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实验介绍
实验原理
通过PARISTM Kit Protein and RNA Isolationg System 核质分离试剂盒将细胞的胞核与胞质分开，提取这两部分的RNA，进行QP检测。检测胞质与胞核中目的基因及内参基因的表达在细胞总表达的占比。
实验方法
Step1: 细胞收集之后，预冷的PBS清洗一遍，3000g离心5min后取上清，置于冰上。加入合适体积预冷的Cell Fractionation Bufeer 重悬细胞，轻轻打匀。冰上孵育10min。
Step2: 孵育10分钟后，500g，4℃离心5min，分离胞浆和胞核。上清转移至新的无RNA酶的EP管中，置于冰上，此为胞浆。
Step3: 胞核沉淀加入预冷的Cell Fractionation Bufeer 重悬，吹打混匀后500g，4℃离心1min，去上清。胞核沉淀中加入预冷的Cell Disruption Buffer ,冰上裂解至溶液均一。(裂解至溶液透明）
Step4: 胞浆和胞核中分别加入等体积的2X Lysis/Binding Solution，上下颠倒混匀，室温裂解。
Step5: 加入与裂解液相同体积的无水乙醇，混合均匀。
Step6: 将混合液分别置于滤柱中过滤，10000g，室温离心1min,丢弃EP管，转移滤柱至试剂盒提供的EP管中进行清洗。
Step7: 加入700ulWash SolutionⅠ10000g，室温离心1min。倒掉液体，滤柱中加入500ulWash Solution2/3，10000g，室温离心,10000g,室温离心1min
Step8：倒掉废液，空管离心一次，10000g，室温离心1min,更换EP管。
Step9：DEPC水加热到95-100℃加35ul至滤柱中央，10000g室温离心30s。丢弃滤柱，分别得到胞浆和胞核的RNA。
案例展示
左：扩增曲线； 右：溶解曲线
通过监测不同循环阶段的荧光强度，直至曲线平滑达到细胞中该基因的表达高峰。Ct值越低，表达越高。
通过2-meanCt公式计算基因在胞核与胞质的表达大小，绘制柱状图，得到基因在胞核与胞质中的表达占比。
技术总结
注意事项：
1. 2X Lysis/Binding Solution可能在4°C下凝固。使用前，将溶液加热至37°C，偶尔搅拌5-10分钟，或直至完全溶解。
2. 洗脱水需要在95-100℃水浴锅中预热，更好的洗脱柱膜上的RNA，不过由于洗脱温度过高可能会导致RNA有些许降解。
交付标准
1. 实验报告
2. 真实实验结果
3. 原始图片
4. 实验原始数据
5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）
电话：400-691-6686
在线时间：8:00-24:00
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