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2024-11-18 21:28:17
稳定表达细胞系构建
【应用简介】
稳转株主要应用于以下研究中：
1、需要长期在目的细胞中研究基因功能。通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也方便长期的实验研究；
2、部分蛋白半衰期及长，瞬时RNA只能干扰表达，无法去除已经表达的目的蛋白，通过构建稳定株可以实验更好的基因干扰效果；
3、瞬转会引入不可预期的拷贝数表达（往往瞬时表达较高），导致因为人为因素造成实验结果的不精确，构建稳定株可以帮助筛选到拷贝数适量的细胞进行实验研究；
4、稳转株可以用于诱导表达系统的实验，用于控制基因的时空表达；
5、需要用目的细胞构建动物模型的实验，往往需要构建成稳定株。
【原理介绍】
将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，因此，慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。
【实验方法】
1、目的细胞的合适抗生素浓度筛选；
2、目的细胞的合适病毒滴度筛选；
3、慢病毒构建与包装与滴度测定；
4、慢病毒感染；
5、特定抗生素筛选稳转细胞株；
6、稳转细胞株鉴定。
案例展示
Hela细胞多克隆稳转细胞株
多克隆稳转株的荧光通常强弱夹杂，从感染72小时后开始加入筛选药物，每隔2天重新换液加入筛选药物。药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察到的荧光细胞比例为100%。
技术总结
稳转株的构建是一个长时间多平台合作的项目，有多种因素容易导致稳转株构建失败：
1、支原体污染问题
细胞支原体轻度的污染不会影响细胞的增殖和生长，但是在病毒感染后容易大规模爆发，进而导致稳转株构建失败；
2、慢病毒保存不当
3、慢病毒制备好后需及时分装并放置于-80℃保存，避免反复冻融；
4、目的基因表达水平低
5、细胞感染病毒后毒性大导致细胞死亡。
送样与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 冻存细胞 | 1.取对数生长期的细胞，消化离心收集细胞，加入冻存液吹打混匀，装入冻存管，标明细胞名称/细胞代数，冻存细胞数量在1-5*106个/ml。 2.项目启动后细胞复苏，复苏后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 复苏后细胞 | 1.使用T25培养瓶运输。细胞汇合度达到60%以上，装满培养液，只留纽扣大小的气泡，瓶口用封口膜封好，标明细胞名称/细胞代数/接种时间/培养基类型，瓶子固定运输。 2.收到细胞后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 常温 | 常温 | |
| 质粒 | 1.纯度高，无内毒素，无蛋白质，基因组DNA/RNA污染，质粒A260:A280的比值在1.8-2.0之间 2.浓度不低于0.5μg/μl，总量大于100μg，无内毒素处理 3. 载体详细信息，包括名称、大小、抗性、荧光标记 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 3.明确是否表达荧光标签蛋白及其种类，最好需要提供病毒载体图谱； | -80℃ | 干冰 |
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在线时间：8:00-24:00
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