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实验介绍
【鉴定方法】
基于SEC+超滤的外泌体分离方法，可方便快捷进行高纯度及高回收率的外泌体分离。以荧光外泌体作为标准品，Exosupur可回收94.87%的荧光外泌体；能够去除99.44%的血浆游离杂蛋白，如主要的miRNA结合蛋白Ago、血浆杂蛋白HAS在Exosupur中更少；跟超离及市面常见试剂盒相比，该方法提取的外泌体的particle数与蛋白含量比值更高，表明分离得外泌体纯度更高，杂蛋白含量更低。
MISEV2018（细胞外囊泡杂志）对外泌体的表征规定了最小试验要求：
① 总体表征：
至少3个阳性（至少包括1个跨膜蛋白和1个细胞溶质蛋白）、1个阴性蛋白质标志物。
② 个体表征：
电镜或原子力显微镜、单颗粒追踪两种方法互为补充。
1、电镜检测
透射电子显微镜观察法（TEM）是从形态和大小上对外泌体进行鉴定。通过负染的方法，在高倍放大下直接观察单个外泌体的形态结构和大小。
检测仪器：透射电子显微镜（HITACHI，H-7650）
样本要求：BCA浓度300-400ng/μl，体积10μl；避免反复冻融，4℃保存，冰袋运输。
结果呈现：
2、粒径检测
粒径分析是从整体上对外泌体大小的分布情况进行检测，具有准确、快速、重复性好等优点，是对现有外泌体鉴定方法的良好补充。
检测仪器：Particle Metrix（ZetaView）
样本要求： 避免反复冻融，4℃保存，冰袋运输。
结果呈现：
样本名称 | 平均粒径(nm) | 粒径主峰(nm) | 主峰所占百分比(%) | 浓度 (Particles / mL) |
血浆 | 105.7 | 85.5 | 99.2 | 1.0E+8 |
3、Western Blot检测
Western blot是通过抗原抗体特异性结合的原理，对外泌体标志蛋白进行检测，从蛋白质层面对外泌体进行鉴定。常用的外泌体标志蛋白包括CD63、TSG101及Alix等。
检测方法：ECL化学发光，传统胶片曝光或者专用曝光仪器。
样本要求：血浆样本BCA量60ug，＞0.5μg/μl；细胞上清BCA量40μg，＞0.5μg/μl；冰袋运输。
结果呈现：
案例展示
技术总结
【常见问题】
1、血浆电镜图片为什么背景那么杂？
答：血浆中杂蛋白如糖蛋白、铁蛋白，低密度脂蛋白等粒径大小与外泌体非常接近，且
含量偏高，现有的分离方法无法完全剔除，所以会出现有一些杂蛋白背景。
2、CD63 条带为什么呈弥散状？这样发文章能用吗？
答：由于 CD63 的糖基化水平不同，导致其条带呈弥散状，这是蛋白本身的特点，所以不会
影响文章的发表。
送检与交付标准
【送检标准】
（一）、血浆样本采集
1、请用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过4 h）；
2、将采集到的血液在4℃下1500 g，离心20 min，去除血液中的细胞；
3、取上清，4℃下3000 g，离心15 min，收集上清（血浆），-80℃保存。
4、送样量： 排阻+超滤 4mL（够2次分离）
超离 4mL
注意事项：①请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放；②请排除乙肝病毒，HIV等病毒感染样本。
（二）、血清样本采集
1、请用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过4 h）；
2、将采集到的血液在4℃下1500 g，离心20 min，去除血液中的细胞；
3、取上清，4℃下13000 g，离心2 min，收集上清（血清），-80℃保存。
4、送样量： 超离 4 mL
排阻+超滤 1mL
注意事项：请排除乙肝病毒，HIV等病毒感染样本。
（三）、尿液样本采集
1、采集前/中后段晨尿约60 mL，若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；
2、将采集到的尿液在4℃下（室温亦可）离心2000 g，20 min，去除尿液中的细胞；-80℃保存；
3、送样量：60 mL。
注意事项：请务必嘱咐患者，①采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；②中段尿请务必去掉最初排出的50-80 mL尿液；③女性受试者，请于采尿前对外阴进行清洗。
（四）、胸水样本采集
1、临床收集胸水后若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；
2、将收集到的胸水1000 g离心10 min，收集上清液；
3、将得到的胸水上清3000 g离心10 min，收集上清，-80℃保存。
4、送样量：30 mL
（五）、腹水样本采集
1、临床收集腹水后若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；
2、将采集到的腹水在4℃下（室温亦可）离心2000 g，20 min，去除腹水中的残渣；-80℃保存；
3、送样量：30 mL。
（六）、脑脊液样本采集
1、采集方式为腰椎穿刺，样本一经分离，请务必立即置于冰上或4℃短暂保存（不得超过4 h），采样时注意避免血液污染；
2、样本室温下2000 g离心20 min去除细胞及部分碎片，取上清，-80℃保存；
3、送样量：5 mL。
注意事项：请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放。
（七）、胆汁样本采集
1、用无菌容器收集胆汁；
2、将收集到的胆汁在4℃下，3000 g离心10 min去除细胞沉渣和碎片；
3、收集胆汁上清液，4℃或者-20℃长期保存；
4、送样量：5 mL。
（八）、细胞样本采集
对于耐受无血清培养的细胞的处理流程：
1、细胞培养：对于贴壁细胞汇合密度在70%以上，用PBS洗涤细胞2-3遍去除残留牛血清，添加无血清培养基，继续培养24小时；
2、上清收集：细胞上清先用200-300g离心10min，再用3000g离心10min，最后0.22um过膜或者10000g离心30min。将处理后的细胞上清经100kd超滤管超滤浓缩（详见参考文献2.1）；
3、储存运输：将处理好的细胞上清收集在无菌培养瓶，-80保存或者干冰运输，体积需求细胞上清原液大于200ml（对应于10cm的大皿，至少需要20大皿）；
4、对于一些状态良好的细胞上清，少至70ml，也可以得到较好的外泌体分离结果。
对于不耐受无血清培养的细胞的处理流程：
1、细胞培养：对于贴壁细胞汇合密度在70%以上，用PBS洗涤细胞2-3遍去除残留牛血清，添加含5%无外泌体血清的培养基，继续培养24小时；
2、上清收集：细胞上清先用200-300g离心10min，再用3000g离心10min，最后0.22um过膜或者10000g离心30min。将处理后的细胞上清经100kd超滤管超滤浓缩（详见参考文献2.1）；
3、储存运输：将处理好的细胞上清收集在无菌培养瓶，-80保存或者干冰运输，体积需求细胞上清原液大于200ml（对应于10cm的大皿，至少需要20大皿）；
4、对于一些状态良好的细胞上清，少至70ml，也可以得到较好的外泌体分离结果。
5、送样量：细胞上清原液建议大于200 mL。
注：细胞上清样本按照送样体积收费，超滤浓缩步骤可选择自己完成也可直接送公司完成。
参考文献：Rong Xu, David W. Greening , Alin Rai, Hong Ji, Richard J. Simpson. Highly-purified exosomes and shed microvesicles isolated from the human colon cancer cell line LIM1863 by sequential centrifugal ultrafiltration are biochemically and functionally distinct. Methods. 2015 .1;87:11-25
【交付标准】
电话：400-691-6686
在线时间：8:00-24:00
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