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2024-11-18 21:28:34
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实验介绍
【应用简介】
衰老细胞的形态变化主要表现为形状变大、变平、胞核增大、核膜内陷、染色质固缩、胞内溶酶体变多等。衰老细胞中细胞器数量尤其是线粒体数量减少，胞质内有色素堆积和空泡形成，最终导致细胞死亡。总体来说衰老细胞的各种结构呈退行性变化。根据其特征，目前常用β-半乳糖苷酶活性检测衰老。
【技术原理】
衰老细胞或组织产生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X—Gal，生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下很容易观察到。在人体表皮角质层细胞中，也可以发现SA-β-gal随年龄的增加而增加。并且，SA-β-gal不依赖于DNA复制，可以区分衰老细胞与静止期的细胞。
【实验方法】
Step1：细胞培养
Step2：细胞转染或药物处理
Step3：处理结束后进行细胞β-半乳糖苷酶检测
Step4：200x镜下观察
案例展示
经过处理后，细胞衰老程度显著增加。
技术总结
细胞在体外培养时，会随着传代次数的增加，衰老情况随之增加，表现为衰老细胞增多或细胞更容易衰老。因此，在细胞传至20代左右时，可取一部分细胞进行β-半乳糖苷酶染色分析，发现阳性结果即诱导成功。如染色不理想，则可增加外部因素处理，如不同浓度的双氧水，处理时间可自己选择，但不宜过长。外部因素处理后，可从中选取部分细胞进行染色分析。或者，在细胞铺板培养过程中，提高细胞的接种密度，同时使用无血清的培养基进行培养，一样选择部分细胞进行染色分析。以上操作可交替进行。直至出现染色阳性结果。
送检与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 冻存细胞 | 1.取对数生长期的细胞，消化离心收集细胞，加入冻存液吹打混匀，装入冻存管，标明细胞名称/细胞代数，冻存细胞数量在1-5*106个/ml。 2.项目启动后细胞复苏，复苏后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 复苏后细胞 | 1.使用T25培养瓶运输。细胞汇合度达到60%以上，装满培养液，只留纽扣大小的气泡，瓶口用封口膜封好，标明细胞名称/细胞代数/接种时间/培养基类型，瓶子固定运输。 2.收到细胞后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 常温 | 常温 | |
| 质粒 | 1.纯度高，无内毒素，无蛋白质，基因组DNA/RNA污染，质粒A260:A280的比值在1.8-2.0之间 2.浓度不低于0.5μg/μl，总量大于100μg，无内毒素处理 3. 载体详细信息，包括名称、大小、抗性、荧光标记 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 3.明确是否表达荧光标签蛋白及其种类，最好需要提供病毒载体图谱； | -80℃ | 干冰 |
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