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实验介绍
【技术原理】
首先标记 RNA（如生物素探针标记 RNA），将其与细胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白质复合物，分离复合物得到蛋白质，通过蛋白免疫印迹（western blot）或质谱（massspectrometry）检测蛋白。
【实验方法】
Step1：生物素探针标记RNA的制备
Step2：RNA抽提
Step3：细胞裂解
Step4：磁珠预处理
Step5：RNA与磁珠结合
Step6：RNA 与蛋白相互作用
Step7：蛋白的检测
【实验流程】
案例展示
Samples were normalized by volume. L = lysate load; FT = flow-through, E = eluate.
【结果分析】
根据Western blotting检测结果可知带标记的AR 3´-UTR RNA可以特异性的结合HuR蛋白。
技术总结
【常见问题】
1、RNA结合蛋白没有结合
可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）缓冲体系不对；（3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低。
解决方法：（1）增加上样蛋白量；（2）应用低盐体系；（3）加入交联试剂。
2、RNA 降解
可能原因：无核酸酶的环境被破坏，比如RNA提取过程中的试剂及材料等；体外转录的RNA探针降解等。
解决方法：清洗和使用新开的离心管和试剂等；RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度。
3、RNA结合蛋白的亲和力不够
可能原因：结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探针用量不足等。
解决方法：优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等。
4、结合的非特异性高
可能原因：（1）缓冲环境没有优化；（2）缓冲环境严谨性低；（3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。
解决方法：（1）优化孵育时间温度盐浓度等条件；（2）使用严谨性高的缓冲体系；（3）调低RNA探针和样品的比例；（4）提高裂解液的量。
5. WB信噪比高
可能原因：（1）阳性信号率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白没有充分溶解。
解决方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化学发光液；（3）用细胞裂解液预孵一抗；（4）增加样品的量；（5）确定有没有其他可能的结合情况；（6）增加裂解液用量。
【注意事项】
1、RIP反应体系中的试剂和抗体中均需保证无RNase；
2、磁珠与带标签的RNA要充分混合，可优化孵育的温度、时间以及RNA的含量等。
送检与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 动物组织 | 单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 种子样本 | 去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 贴壁/悬浮细胞 | 1. 总RNA或蛋白：106cell/指标、浆/核RNA或蛋白：107cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*107 cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清样品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蜡包埋样品 | 由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm； 新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗体 | 1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物， 附带公司引物合成单。 | -20℃ | 冰袋或常温 |
电话：400-691-6686
在线时间：8:00-24:00
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