大家好！今天普拉特泽生物继续跟大家一起学习新的技术——RNAi研究策略与siRNA的设计。
RNAi（RNA干扰）是一种强大的生物学工具，用于研究基因功能、疾病治疗等领域。在shRNA,siRNA等小RNA的介导下，RNAi能够特异性的调控mRNA在表观遗传学水平，转录水平以及转录后水平的表达。
一、siRNA和shRNA的简介
小干扰RNA（Small interfering RNA，简称siRNA）是一类双链RNA分子，长度通常在20到25个核苷酸之间。siRNA由两条互补的RNA链组成，每条链的3'端通常具有两个未配对的核苷酸（通常是UU）。

siRNA

短发夹RNA（short hairpin RNA，简称shRNA）是一种具有环状结构的RNA分子。shRNA由两个短反向重复序列和一个中间的茎环（loop）序列组成，整体呈发夹状结构。shRNA通常由pol Ⅲ启动子控制转录。

shRNA

shRNA表达载体

RNAi是一种由双链RNA（dsRNA）介导的、序列特异性的基因沉默机制。当细胞中存在与靶基因mRNA序列互补的dsRNA时，这种dsRNA会被细胞内的Dicer酶切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA，即小干扰RNA（siRNA）。这些siRNA随后与RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合，形成活化的RISC复合物。RISC复合物具有核酸酶的功能，能够识别并切割与siRNA互补的靶mRNA序列，导致靶mRNA的降解，从而抑制靶基因的表达。dsRNA可以通过多种方式引入细胞，如人工合成、病毒侵染、转基因表达等。
一、RNAi研究策略
1. 直接合成siRNA

方法：通过化学方法合成针对靶基因的siRNA，然后通过转染试剂将其导入细胞内，引发RNAi效应。

2. 构建shRNA表达载体

方法：将短发夹RNA（shRNA）序列克隆到质粒或病毒载体中，转染细胞后，在细胞内转录生成shRNA，再被Dicer酶切割成siRNA，发挥RNAi作用。

3.构建shRNA病毒表达载体

方法：利用腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等病毒载体，将shRNA序列包装成病毒颗粒，感染细胞后表达shRNA。

二、shRNA设计步骤
设计原则：

当选择U6启动子时，建议靶向序列以G碱基开头，以确保RNA聚合酶的有效转录。

避免选择GC含量过高或过低的区域，因为这可能影响shRNA的稳定性和干扰效率

在正义链和反义链序列上不能出现连续的3个或者3个以上的T，这可能导致RNA polⅢ的转录提前终止

需要在shRNA序列的尾部加入5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子，以确保转录的精确结束。

shRNA引物设计步骤：（载体为pPLKO.1为例）

今天关于RNAi研究策略与siRNA的设计就分享到这儿啦~如果您在实验过程中遇到技术问题，或者需要实验外包和代做，可与我们技术老师联系18570028002（微信同号）