ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用的生物检测技术，主要用于检测体液中的蛋白质、抗体、抗原等生物分子。普拉特泽生物承接ELISA实验等表达检测相关服务上万例，积累了操作大量经验，本文将详细介绍ELISA实验的各个步骤，包括固相载体选择、包被、封闭、加样及孵育、洗涤、显色和结果分析。普拉特泽生物帮助科研小伙伴们轻松上手检测，还可承接ELISA实验外包服务

一、实验前准备

在进行ELISA实验前，需要做好充分的准备工作。首先，选择合适的试剂盒，确保试剂盒的检测范围和灵敏度符合实验需求。同时，提前订购和准备试剂及耗材，如ELISA板、抗体、酶标物、洗涤液等。

此外，样本的收集和处理也至关重要。在收集标本前，需要有一个完整的计划，确保检测的成分足够稳定。新鲜标本应尽早检测，如需周期收集，应分装后储存在-20°C或-80°C条件下，避免反复冻融。

二、固相载体选择

ELISA实验常用的固相载体是聚苯乙烯或聚氯乙烯微孔板。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，且抗体或抗原吸附后保留原有的免疫学活性。而聚氯乙烯的吸附性能更高，但空白值也略高。选择时，应综合考虑吸附性能和空白值，选择性能优良的ELISA板。

三、包被

㈠板孔选择：使用ELISA级别的微孔板。

㈡抗体选择：选择优质的ELISA抗体，并根据推荐浓度进行稀释或摸索最适浓度。

㈢包被缓冲液：常用pH7.2的磷酸盐缓冲液。

㈣包被温度和时间：可选择2-8°C过夜包被或室温（37°C）包被2小时。

㈤包被浓度：一般包被浓度为1-2μg/ml，具体根据载体和包被物的性质调整。

四、封闭

包被后应立即进行封闭，以减少非特异性抗体的结合。选择效果较好的封闭剂，如细胞培养级BSA或Tween等。

五、加样及孵育

①加样：将样品加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部。

②孵育：根据试剂盒说明书设定孵育时间和温度。建议加样孵育时使用shaker震荡仪，以保证样品与抗体充分反应。

③检测抗体和酶标物：严格按照说明书稀释检测抗体和酶标物，并控制孵育时间和温度。

六、洗涤

洗涤是ELISA实验中极其关键的步骤，不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象。洗涤时，应严格按照说明书操作，不要减少洗涤次数、洗涤时间和洗涤体积。每次洗板后轻叩几下，最后一次一定要扣干净。

七、显色

每孔先加入显色剂A和显色剂B，轻轻震荡混匀，然后在37°C避光显色一定时间（如10分钟）。显色完成后，每孔加入终止液终止反应，此时颜色由蓝色转变为黄色。

八、结果分析

以空白孔调零，使用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度（OD值）。根据标准品的OD值和浓度绘制标准曲线，通过样品的OD值在标准曲线上查找对应的浓度。

九、注意事项

①标准化操作：严格按照说明书操作，减少实验误差。

②洗涤彻底：洗涤是ELISA实验中最多次数的操作，必须保证洗涤充分。

③避免交叉污染：每次洗板后更换新的封板膜，避免重复使用。

④样本处理：确保样本新鲜且稳定，避免反复冻融。

通过以上步骤和注意事项，我们可以轻松上手ELISA实验，实现高效、精准的生物检测。ELISA作为一种重要的生物检测技术，在医学、生物学等领域具有广泛的应用前景。

冰冻三尺，非一日之寒，普拉特泽致力于帮助广大科研工作者解决ELISA实验中的各方面问题，不但授人以鱼，亦授人以渔。