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2024-11-19 09:30:17
实验介绍
【技术原理】
DNA分子中由于发生碱基对的增添、缺失或改变进而引起基因结构的改变，称为基因突变。定点突变 （mutagenesis）是通过PCR等方法向目的DNA片段中引入突变，包括碱基的添加、删除、点突变等。该技术能迅速、高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是研究人员在实验室中改造、优化基因常用的一种非常有用的手段。目前，由PCR介导的定点突变相比于其他突变技术具有周期短、成功率高、不受酶切位点限制等优点，是使用最普遍的定点突变方法。
【实验流程】
案例展示
常见问题
常见问题1：质粒模板无法正常扩增
可能原因及解决方法：
（1）引物设计有误：核对引物设计方案；
（2）扩增体系配制错误：重复实验；
（3） 扩增反应条件不优化：调整Mg浓度、酶量、扩增程序；
（4）模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。
常见问题2：平板上长不出克隆或克隆数目很少
可能原因及解决方法：
（1）感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率>cfuμg。每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率；
（2）重组反应体系中DNA量不足,或者比例不佳(双碱基突变)：尽量按照推荐DNA的量配制反应体系；
（3） 重组环化反应体系中DNA不纯,抑制反应：未纯化DpnI消化产物加入重组反应体系内的总体积不应超过μl(反应体系体积)。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化；
（4）感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的，否则会降低转化效率；
（5）出现转化抑制效应：当转化的DNA浓度太高时，会抑制转化反应。将重组反应产物稀释倍后取进行转化。
常见问题3：定点突变未正确完成
可能原因及解决方法：
（1）引物设计错误：核对引物设计方案；
（2）扩增反应所用模板为非甲基化的质粒：DpnI只能识别甲基化DNA，请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板；
（3）扩增反应使用过多的模板质粒：对于大多数质粒，ng模板量已足以使扩增反应正常进行，过多的质粒模板将会导致DpnI消化不完全，降低突变成功率。
常见问题4：非目标位点突变
可能原因及解决方法：
（1）模板质粒携带未知位点突变：测序确认模板质粒序列正确性。
（2）扩增循环数过多：为了防止扩增过程中引入非目标突变，扩增循环数不宜超过30。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数应不超过35。
送检与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 动物组织 | 单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 种子样本 | 去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 贴壁/悬浮细胞 | 1. 总RNA或蛋白：106cell/指标、浆/核RNA或蛋白：107cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*107 cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清样品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蜡包埋样品 | 由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm； 新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗体 | 1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物， 附带公司引物合成单。 | -20℃ | 冰袋或常温 |
电话：400-691-6686
在线时间：8:00-24:00
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