——检测293T细胞中Myc的表达
前两篇我们总结了Western blot实验结果中WB检测实验报告和详细的操作步骤（上）今天来学习WB实验操作下篇，希望大家学习参考，能够顺利进行实验，普拉特泽表达检测实验平台长期为大家提供WB实验代做外包服务。

一、实验目的

利用Western Blot技术检验不同的处理之后，293T细胞中Myc蛋白的表达量变化。

二、实验样本及分组

2.1 实验样本

2.2 实验分组
细胞：293T细胞

分组：Control、pCMV-Myc、EGFR-TK-pCMV-Myc、EGFR-TK(S720A)-pCMV-Myc

三、实验结果

3.1 抗体工作信息

3.2 WB检测293T细胞中Myc的蛋白水平

图1 Myc的WB表达水平检测图

图2Myc的WB检测灰度数据柱形图

四、实验材料

5.1主要仪器

5.2主要试剂

五、实验原理

蛋白免疫印迹( Western Blot) 采用的是聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的特异性抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

六、实验步骤

7.1.蛋白提取

(1)样本的收集：

细胞：用1 ml生理盐水对离心下来的细胞进行洗涤，同时将其转移至1.5 ml的离心管中。

组织：取适量组织剪碎，研磨匀浆。

(2)按1 ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

(3)根据细胞量的多少，每管细胞加100-500 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。

(4)4℃下12000 rpm离心10 min。离心后的上清分装转移至1.5 ml的离心管中，用于蛋白定量检测。若不能及时定量蛋白浓度，请置于－80℃保存。

7.2.蛋白定量及处理（BCA法）

(1)使用时将BCA试剂盒中 Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B(50:1)配置适量BCA工作液，充分混匀后即成淡绿色的工作液。BCA工作液室温24 h内稳定。

(2)将标准品（1mg/ml BSA）按0、1、2、4、6、8、10 μl的量分别加入96孔板中，再加入去离子水将所有标准品补足到10 μl。

(3)加1 μl的样品到96孔板中，加去离子水补足到10 μl。

(4)各孔加入200 μl BCA工作液，轻轻用移液器吹打混匀（注意不要产生气泡以免影响读数），37℃孵育30 min。

(5)冷却到室温后，用酶标仪测定A562的吸光度值。

(6)根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

(7)蛋白变性处理：蛋白溶液与5×loading buffer 按照体积比4：1混匀（此时蛋白浓度变成实际检测浓度的0.8倍），置于沸水中煮10min，冷却后进行SDS-PAGE电泳，或储存于-80℃，避免反复冻融。

(8)蛋白浓度的计算公式

举例标曲为：Y=aX+b(Y为OD值，X为测定浓度）

样品蛋白浓度=[（Y-b）/a]×稀释倍数

7.3.Western Blot

(1)配制分离胶和浓缩胶：根据目的蛋白分子量大小，配分离胶和5%浓缩胶；

蛋白分子量（kDa）分离胶浓度%

：计算含20~80 μg蛋白的溶液体积，即为上样量。用1×loading buffer 补至每个加样孔的总体积一致；

(3)电泳：浓缩胶电压为80 V，40 min，分离胶电压120 V，30-50 min。溴酚蓝跑至胶底即可终止电泳，进行转膜；

(4)转膜：恒压100V，0.45/0.22 μm PVDF膜；

(5)封闭： 将PVDF膜完全浸没在5% milk-PBST或5% BSA-PBST中，室温轻摇60 min或4℃过夜；

(6)一抗孵育：用5% BSA-PBST稀释一抗，4℃孵育过夜；

(7)洗膜：次日取出PVDF膜，PBST洗膜5次，每次6 min；

(8)二抗孵育：PBST稀释二抗，室温孵育60 min；

(9)洗膜：PBST洗膜5次，每次6 min；

(10)显影：ECL A和B液按体积1:1混合后均匀滴加在膜上，按需求设置曝光时间及曝光类型，开始曝光，曝光结束后保存图片并导出图片。

7.4.图像分析

用图像分析软件Image J对图像进行灰度分析。

好啦，WB检测实验报告和详细的操作步骤（下）咱们就介绍完啦，如果您也对WB实验感兴趣或正在准备WB实验的话欢迎随时咨询普拉特泽生物~