Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作为常见的关系验证方法。它们可以从检验的出发点来区分：co-IP、ChIP、RIP是利用已知的蛋白检测体内相关蛋白、DNA、RNA，并通过蛋白抗体免疫沉淀分离目标蛋白、DNA、RNA。Pulldown则是根据已知RNA（RNA pulldown）或者已知蛋白（GST pulldown）体外检验相关蛋白。

免疫共沉淀co-IP

抗体与细胞裂解液或蛋白表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）（或二抗）偶联的琼脂糖微珠孵育，通过离心得到微珠-蛋白A/G（或二抗）-抗体-目的蛋白复合物。复合物沉淀经离心洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，沸水浴5-10 min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体（轻链和重链已断开）和靶标蛋白。该上清混合物经SDS-PAGE电泳分离和Western blotting显影，最终依据显影后的胶片上是否有目的蛋白条带，来判断免疫沉淀实验是否成功。

实验方法

Step1: 蛋白样品准备，细胞需提前裂解

Step2: 抗原抗体结合

Step3: protein A 琼脂糖珠与抗体结合

Step4: 免疫沉淀分离

Step5: 洗脱蛋白复合物

Step6: WB或质谱分析

染色质免疫沉淀ChIP

ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。在生理状态下，把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应， 将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，再通过多种下游检测技术（定量PCR、基因芯片、测序等）来检测此富集片段的DNA序列。

实验方法

Step1: 交联蛋白与DNA

Step2: 超声破碎使染色质片段化

Step3:细胞裂解

Step4: 抗体结合特定蛋白抗原

Step5: 通过beads沉淀复合物并洗脱

Step6: qPCR扩增或基因测序

RNA免疫沉淀RIP

主要是用来研究体内RNA与蛋白结合情况，利用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，通过分离纯化，对结合在复合物上的RNA 进行RT-PCR验证或测序分析，了解转录后调控网络动态过程。

实验方法

Step1：靶蛋白-RNA交联形成复合物（RNP）超声剪切RNA链成小段

Step2：细胞裂解，将RNP与抗体、微珠连接

Step3：微珠-抗体-RNP形成沉淀

Step4：将RNP从微珠-抗体上洗脱，并将RNA与蛋白解交联，纯化RNA

Step5：qPCR检测或测序分析

RNA Pulldown

RNA Pulldown是研究RNA与蛋白质相互作用的一种技术。利用生物素标记的RNA探针，通过与含有目的蛋白的溶液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。复合物可以特异性结合磁珠，从而与孵育液中的其他蛋白分离。复合物洗脱后，通过蛋白凝胶电泳实验，检测特定的RNA与蛋白的结合情况。

实验方法

Step1：生物素标记目标目标RNA；

Step2：磁珠结合目标RNA；

Step3：目标RNA与蛋白结合；

Step4：通过磁场固定磁珠，将蛋白分离纯化；

Step5：通过WB鉴定或质谱检测。

GST Pulldown

GST Pulldown将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验方法

Step1：Glutathione琼脂糖珠预处理；

Step2：GST融合蛋白挂柱；

Step3：细胞裂解；

Step4：将细胞裂解液上清加入beads；

Step5：加上SDS上样缓冲液；

Step6：SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。

案例展示

ChIP案例分析：

1. 阳性对照组条带清晰可见，阴性对照组正常，表明CHIP实验操作可行；

2. input对照组条带清晰可见，表明PCR扩增引物可用；

3. 抗体A实验组有目的条带，表明基因与转录抑制因子蛋白均可发生结合。

RIP案例分析：

1. 阳性对照组条带清晰可见，阴性对照组正常，表明RIP实验操作可行；

2. input对照组条带清晰可见，表明PCR扩增引物可用；

3. 抗体A实验组有目的条带，表明RNA与蛋白可发生结合。