荧光定量PCR实验常见问题及其解决方法由普拉特泽生物为大家总结分享，普拉特泽生物表达检测平台专业承接荧光定量PCR实验代做服务，在实时荧光定量PCR的实验操作中积累了大量的经验，同时也遇到了不计其数的问题，表达检测实验的技术在一次又一次实践中总结了遇到各种常见问题的原因和解决方法。本文就跟大家一起来看实验过程中出现频率最高的一些问题：

        1、RNA得率低

        原因1：样品裂解不完全

        解决：适当选择起始材料的量，加入合适体积的裂解液。

        原因2：匀浆不充分

        解决：减少材料的数量; 根据材料类型选择合适匀浆方法; 组织样本适宜切成小块后，在Trizol试剂中均质，充分裂解。

        原因3：用于分光光度分析的稀释液PH值太低

        解决：使用TE（PH 8.0）作为稀释液进行读数测定。

        2、RNA降解

        问题1：RNA酶污染

        解决：戴上手套操作，勤换手套; 耗材与试剂均应作RNase-free处理; 操作中减少EP管的开盖次数与时间。

        问题2：样品处理不当

        解决：新鲜组织收获后，立即冻结在-70℃或液氮中; 也可以在Trizol试剂中均质后，-70℃下储存。

        3、Abs260/Abs280比值低

        问题1：酸性pH降低吸光度比率

        解决：使用TE缓冲液(pH 8.0)作为稀释液进行测定。

        问题2：水相被酚相污染

        解决：小心转移上层水相，避免吸入中间相，可留少许上层相不吸取。

        4、DNA 污染

        问题1：Trizol加少了，造成DNA /核蛋白复合物与RNA水相分离不完全

        解决：适当选择起始材料的量，加入合适体积的裂解液。

        问题2：水相被苯酚相污染

        解决：小心转移上层水相，避免吸入中间相，可留少许上层相不吸取。

        5、下游反应中RNA表现不佳

        问题1：乙醇或盐类污染

        解决：溶解RNA之前，注意洗涤沉淀，并通过空离和风干除去残留。

        6、熔解曲线有杂峰

        问题1：引物二聚体

        解决：

        （1）提高退火温度

        （2）降低引物浓度，甚至调整正向引物和反向引物的比例。 一般引物最终浓度设定为200 nM，但如有必要，可降低至60 nM。

        （3）镁离子的浓度最好在3 mM左右。 高于这个浓度，引物二聚体更易形成;

        （4）重新设计引物并评估它们的二聚化倾向。

        问题2：非特异性扩增

        解决：重新设计引物并通过预实验评估特异性。

        问题3：cDNA模板降解

        解决：模板避免反复冻融，可适当分装保存，每次取用一小管。

        7、无扩增信号

        原因：低表达，反转录，或定量仪器问题

        好啦！那实时荧光定量PCR实验常见问题及其解决方法咱们就分享到这里啦！希望能帮到大家哦，如果您遇到了更多解决不了的问题或需要外包实时荧光定量PCR实验，欢迎随时留言哦~咱们下期见！