实时荧光定量PCR技术答疑由普拉特泽生物技术总结分享。实时荧光定量PCR是普拉特泽生物——表达检测平台的常规实验，本文主要根据普拉特泽生物承接的所有的荧光定量PCR实验特殊问题与进行实验技术咨询的同学常常提出的问题总结，分享给大家：

1、实时荧光定量技术是什么？有什么用？

    实时荧光定量PCR技术（Real-time qPCR），其基本原理是在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光染料探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。荧光定量PCR最大的优势可以对初始模板进行定量，目前已广泛应用于生命科学、医学研究等领域。
2、CT值是什么？实验结果没有CT值怎么回事？

    在相对定量中，Ct值一般控制在15~25之间比较好，如果在绝对定量中，对低拷贝数的样品，Ct值会增大，但是一般不宜超过40循环，否则定量不准确。因此，判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况，需要根据具体实验设计和目的进行。可能原因主要是：

    （1）扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适，需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；

    （2）PCR程序不合适，改用三步法进行反应，或者优化退火/延伸温度，可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短（可以在推荐的时间条件下延长10s）；

    （3）MgCl2浓度不合适，增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；

    （4）PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp；

    （5）模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

3、我的荧光定量PCR结果标准曲线线性关系不佳怎么回事？

    如果遇到标准曲线线性关系不佳）的情况，那么很有可能是以下环节存在问题：

    （1）标准品稀释或者加样存在误差，吸样不准，使得标准品不呈梯度；

    （2）标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，将高浓度DNA模板分装，保存于-20℃或-80℃，不要反复冻融，现配现用；

    （3）引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针；

    （4）模板中存在抑制物。模板浓度过高，根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量不超过500ng，以50~500ng为宜。

4、为什么我的阴性对照扩增有信号？

    如果阴性对照扩增有信号，首先排查各操作环节是否有不当，造成交叉污染：

    （1）引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

    （2）引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

    （3）镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒。

    （4）模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。

    （5）交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染，或操作环境中有气溶胶造成污染，建议对操作环境进行处理，或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。

5、为什么我的扩增曲线是S形的？

    如果遇到扩增曲线异常，很有可能是以下环节存在问题：

    （1）模板的浓度太高或者降解；

    （2）荧光染料的降解；

    （3）在操作荧光定量PCR时，带上新的一次性手套，盖上避免任何指纹或者字迹等；

    （4）液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发，没有很好的聚集在管子里；

    （5）气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。

    好啦，表达检测平台常常收到的技术咨询就是这么多啦，如果您关于荧光定量PCR还有其他的问题或者实验需要外包欢迎给客服留言，咱们一起学习共勉~