大家好！本期普拉特泽生物跟大家一起学习的是SNP/单核苷酸多态性检测最常用的几种方法，SNP常用检测方法总结由普拉特泽生物表达检测平台总结分享。SNP检测服务是检测染色体基因组中单个核苷酸的突变而引起的DNA序列的多态性的技术服务，作为表达检测平台的常规实验，我们积累了大量的实操经验与案例，无论是SNP检测外包还是技术咨询，我们都会给到最专业的回复，现在我们就来看看我们表达检测平台最常用的三种检测SNP方法吧！

        1、Taqman探针法(定性)

        针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。

        高分辨率熔解曲线分析（HRM）是近几年兴起的SNP研究工具，它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。

   2、直接测序法

        Sanger测序是DNA序列分析的经典方法，可直接获取核酸序列信息，是SNP检测的“金标准”。而且，Sanger测序可发现未知的 SNP位点，确定SNP 的突变类型和突变位置，是一种无法替代的最直接、最准确的SNP检测方法。

        采用测序法检测SNP时，首先可将含有SNP位点的靶标序列通过PCR扩增形成DNA片段后，再利用Sanger测序获取目标区域的核酸序列，并对SNP位点进行比对，由此即可确定是否存在变异位点。

        Sanger测序是基于双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）末端终止的方法进行检测的。即在四个单独的反应体系中，分别对应掺入四种带有不同颜色标记的A、T、G、C双脱氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定点开始延伸反应，而延伸过程中若掺入ddNTP，则由于碱基上无3’-OH导致延伸无法继续，从而随机在某一特定碱基处终止，形成相差一个碱基的不同系列长度的核酸片段，再利用毛细管电泳分离这些不同长度的核酸片段，最后通过不同碱基标记的颜色读取待测核酸的碱基序列，由此获得目标区域的核苷酸序列。

        3、ARMS-PCR法

        扩增阻滞突变系统PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR），又称为等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR, AS-PCR），是基于Taq DNA 聚合酶无法修复引物3’末端的单个碱基错配，从而使得扩增受阻的检测方法。在扩增过程中，只有当引物3’末端的碱基与SNP位点的等位基因互补配对时，才能正常延伸扩增；而当引物3’末端的碱基与SNP位点的等位基因不互补配对时，则不发生扩增反应，由此对扩增产物进行凝胶电泳或荧光PCR检测，则可确定SNP基因型。

        ARMS-PCR法的荧光PCR检测时，同样使用TaqMan探针，只是将SNP位点设计在引物3’末端，因此理论上只有引物3’端与模板完全匹配时，才能形成扩增曲线；但在实际检测时，单个碱基的错配依然可以延伸扩增，只是效率较低。为了提高其特异性，有时需在靠近引物3’末端的位置人为引入错配碱基，以降低非靶标序列的扩增效率。

        实际操作中，我们最常用的三种检测SNP的方法就是：Taqman探针法、直接测序法和ARMS-PCR法，当然检测SNP有很多的方法，如果您准备学习SNP检测或有SNP检测外包代做的需求欢迎给客服留言，技术会技术联系回复您，那我们下篇一起学习SNP检测的另外几种检测方法~咱们下期见！