一、甲基化是什么

   甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA) 加工。

   甲基化分为两类：

1、蛋白质甲基化：一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化；

2、DNA甲基化：指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基基团。（包括RNA甲基化，我们这里主要讲DNA甲基化）

二、甲基化检测的几种常见方法

1、HRM（高分辨率熔解曲线分析）

2、MSP（甲基化特异性的PCR），可以对某个特定的基因做定性分析

3、酶切法，针对总DNA的一种定性方法，不能针对某个具体的基因

4、BSP（亚硫酸氢盐测序法），可以明确到某个特定的基因、特定的区域、特定的CG位点。这也是比较推荐的金标准。

我们今天主要讲后三种方法。

三、甲基化检测的几种方法的实验原理

1、基于亚硫酸氢盐修饰的甲基化检测原理（BSP和MSP）

甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

2、酶切法实验原理

使用两个对甲基化敏感性不同的限制酶来分析特定位点的DNA甲基化状态。EpiMspl和EpiHpall是具有CCGG特异性的同分异构体。当5'-CCGG-3'四核苷酸中的内部CpG甲基化时，EpiHpall的切割被阻断， 但EpiMspl的切割不受影响。

四、甲基化检测的几种方法的实验流程

1、BSP/MSP的实验流程

2、酶切法实验流程

五、甲基化检测的几种方法的优缺点总结

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