普拉特泽生物为广大生命科学研究人员提供QPCR检测实验，可根据实方案的要求选择不同的检测方法，本文就跟大家一起继续阐述QPCR检测实验详细的步骤与报告。
一、实验目的

通过QPCR实验技术定量检测基因表达量。

二、实验样品及分组

1. 实验样本

备注：包括干预细胞用的相关试剂均按实验样品登记，每行登记一个或一组独立样品。

2 .实验分组

细胞： SH-SY5Y

分组：

常规培养条件：完全培养基，95%空气+5%二氧化碳；

OGD培养条件：无糖Earle液，95%氮气+5%二氧化碳处理4h，复氧复糖24h

指标：1、核质分离后检测lncRNA BDNF-AS（NR_002832.2）

2、提取总RNA检测BDNF（Gene ID: 627）、APP（ Gene ID: 351）、BACE1（ Gene ID: 23621）、BDNF-AS的表达（默认最长的转录本）

三、实验结果

四、实验材料

1.主要实验仪器

2.主要实验试剂及耗材

五、实验原理

QPCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。根据荧光信号的变化能够实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析就能对起始模板进行定量分析。

六、实验步骤

1.引物设计

2.样品前期处理

向细胞样本中加入500 μl Trizol。
3. RNA提取

(1)     向加有Trizol的1.5 ml EP管中加入100 μl氯仿，震荡混匀后，静置5 min，在12000 rpm，4度离心10 min。

(2)     从离心机中取出1.5 ml EP管，再将上层无色透明的水相层吸入到另一干净的1.5 mlEP管中。（样品会分为三层：下层有机相层，中间层和上层的水相层，RNA位于上层水相中。）加入等体积的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀之后，静置10 min，再12000 rpm，4度离心10 min。

(3)     离心之后可在EP管壁或管底看到胶状沉淀出现，沉淀就是要提取的RNA。小心弃去上清，不要将沉淀倒掉了。

(4)     用1 ml 75℅乙醇对RNA沉淀进行洗涤。然后于4℃ 7000 rpm离心5分钟，将上清尽量去除干净。

(5)      室温静置干燥，大约干燥5～10分钟即可。（不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低）。所有EP管中加入25 μl 的DEPC H₂O，用枪头吹打几次，使RNA充分溶解，-80℃保存。

(6)     RNA浓度检测：使用核酸蛋白检测仪检测RNA浓度。

4.RNA浓度及纯度测定

（见实验结果部分）

5.逆转录PCR

1. 按以下组份分别配制逆转录反应液：

  2.cDNA立刻进行实验或者置于4℃保存。

六、实时荧光定量PCR反应

1. 反应体系的配置

2.反应条件设置：

     扩增程序：

3.熔解程序

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