到九月了哦~娇小可爱的萌新师妹来了哦，有木有很开心呀！！

那么问题就来了：论如何在师妹面前装一手好Bility呢？不想装Bility的科研狗可不是正经科研狗，装不了Bility的科研狗更是没能力的科研狗！

正所谓：爱也WB（顺利一跑就跑出来了），恨也WB（不顺利作死的也跑不出）。作为科研工作的基础实验技术，晓其原理、知其操作、懂其分析，并能做出一块“内参条带均匀平整，目的条带错落有序”的好膜，必将助你在装Bility路上独领风骚！

下面就简单介绍下WB实验技术：

1. Western blot是干啥的。简单来说就是①检测蛋白质混合溶液中某种特定蛋白质的存在与否（定性）；②确定同一蛋白质在不同样本中的多与少（半定量）。

2. 内参蛋白是啥玩意。内参就是内部参照，对于哺乳动物来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定。比如常用的内参β-actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。依据不同的目的蛋白选择合适的内参。

3. BCA法是个啥。碱性环境下蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，BCA与一价铜离子结合形成紫蓝色络合物，在562nm处有最大吸光值且与蛋白浓度成正比。（个人觉得可以顺带给师妹讲一下ELISA酶联免疫吸附反应）

4. 电泳之PAGE的浓缩效应与分子筛作用。①电泳开始阶段，由于不连续pH梯度而将样品压缩成一条狭窄区带，提高分离效果；②PAGE具有三维网状结构，能起分子筛作用。

5. 蛋白变性之SDS。影响电泳的3因素：蛋白质的大小、形状及所带电荷。①SDS结合蛋白质后再加热，能把折叠的蛋白质打开，排除形状的影响；②SDS带强负电荷，结合蛋白质后使其原有电荷微不足道，排除所带电荷的影响。SO，电泳结果只跟蛋白质分子量有关。

6. 十万个为什么之封水。封水目的是是分离胶表面平直并排除气泡，so，均匀且匀速，可以轻微晃荡（轻微啊！晃不好别怪我！）。胶水之间形成清晰界面是凝胶聚好的标志。

7. 十万个为什么之上样量一致。这个就不用多讲了吧。上样量不一致蛋白质含量不一致，最后的条带结果有什么意义呢？

8. 转膜的故事。这个也比较简单，手轻点不要弄破了、不要有气泡、膜的大小适合（PVDF膜还是有点小贵的，年轻人不要浪费！）。最好做个标记（我会在一个角剪一丢丢），标记正反面哦！

9. 封闭与抗体孵育的故事。一抗特异性结合蛋白质，标记有HRP（跟显色底物反应）的二抗特异性的结合一抗，易于检测。封闭就是为了防止抗体与膜的非特异性结合产生高背景。我一般一抗用一次，二抗回收（最多用三次）。脱脂牛奶容易发臭的！用不完及时丢！

一点小建议：

①请做一块好胶！胶的影响挺大的。玻璃板洗干净一点！

②预实验一定要做！怎么也得有三个抗体梯度吧。不然一顿操作猛如虎，条带结果一团糊。

③请做好个人防护，制胶材料有很多神经毒素的！