ELISA酶联免疫吸附实验操作注意事项由普拉特泽生物表达检测平台技术支持为大家总结分享，普拉特泽表达检测平台承接上千例ELISA实验代做，积累了丰富的操作经验与理论知识，本文给大家把ELISA实验操作时的注意事项分享出来，小白们一起来充电学习吧！

   夹心法ELISA操作注意事项：

   1、可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。

   2、包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。

   3、对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。

   4、用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定OD值，选择OD值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。

   5、抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。

   间接法ELISA操作注意事项：

   1、应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。

   2、为了使特异性结合的抗体量尽可能多，包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。

   3、在孵育或洗涤过程中，已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来。从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处，增加本底颜色，产生假阳性反应。

   4、在稀释剂及洗涤剂中加入各种保护性阻剂可用来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。

   5、在稀释剂和洗涤剂中所加的吐温-20很重要。它不仅能消除非特异性的本底反应，而且还可增加阳性标本的敏感度，这可能与吐温-20能分离所吸附的非特异性物质有关。目前采用的洗涤剂为PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐温-20，如无吐温-20，也可用吐温故-40或吐温-60代替。但吐温-80本底较高，不宜应用。
   好啦，关于ELISA实验操作过程中的注意事项我们就讲到这里啦，操作视频教程点击：ELISA 理论+实操，欢迎大家留言讨论咨询哦

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