ELISA酶联免疫吸附实验的详细步骤由普拉特泽生物旗下科研培训品牌——春风学院给大家总结分享，普拉特泽生物自建3000㎡生物实验室，专业承接各类生物实验外包服务，ELISA作为表达检测平台的常规实验，承接了上千例的实验代做，积累了丰富的实操经验，文章末更为大家附上ELISA实验的视频教程，一起来学习吧！

   上篇给大家讲到，ELISA分为多种不同的检测方法，今天我们就从直接法ELISA、间接法ELISA、夹心法ELISA、竞争法ELISA四种方法给大家详细讲解。

   一、直接法ELISA详细实验步骤

   将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。

直接ELISA操作很简单，步骤也比较简练，但是其应用范围还是非常有限的，一个重要的原因是这种ELISA中只经过了一步信号放大（酶的放大），所以其灵敏度不是很高；另外，其测定的对象也非常有限，只能测定酶标记的分子。

   二、间接法ELISA详细实验步骤（具体操作可以参考说明书哦）

   1、包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20 ug/ml）各0.3 ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时，贮存冰箱。

   2、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

   3、加被检标本：每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0. 2 mL，37℃，作用1～2小时。

   4、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

   5、加入酶结合物：每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2 mL37℃作用1～2小时。

   6、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

   7、加入0.2 mL底物溶液于每个凹孔（OPD或OT），室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 mL底物加0.1 mL终止剂）。

   8、加终止剂：每凹孔加2 M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 mL。

   9、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492 nm）OD值。

   三、夹心法ELISA详细实验步骤

   1、将具有专一性的抗体固着（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体。

   2、 加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结。

   3、洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结。

   4、洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结。

   5、洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。

   四、竞争法ELISA详细实验步骤

   1、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。

   2、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

   3、分2组，a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2 ml，b组只加酶标记抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度）

   4、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

   5、加入0.2 ml底物溶液于每个凹孔（OPD或OT），室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1  mL终止剂）。

   6、加终止剂：每凹孔加2 M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 mL。

   7、用酶标比色计测定a、b两组OD值，并求出a、b、OD值的差数。

   好啦，ELISA实验的详细实验操作步骤我们就分享那个到这里啦，没看懂的可以点击：ELISA理论+实操更加认真学习哦~需要更多生物实验学习或外包的同学欢迎随时留言哦~