上期的文献分享，我们讲了关于RNA甲基化一篇影响因子6分左右的SCI。今天，我们一起来看看影响因子12左右的文章怎么研究RNA甲基化的吧~

这次分享的文献题目是：Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A，影响因子为11.492分，发表在2020年12月的RESEARCH ARTICLE 杂志上。

想了解高分文章是怎么研究RNA甲基化的伙伴们，现在就跟着我，踏着之前文献解读里整理的“标准步骤”往下看吧~

一、缺氧损害血管生成能力，巨细胞胚胎干细胞中ALKBH5表达上调

为了阐明m6A在缺血后血管生成中的作用，作者分离了心脏微血管内皮细胞（CMECs）。CCK-8实验发现CMECs的存活能力在缺氧3小时后开始增加，在12小时时达到峰值，在24小时后又显著下降（Figure 1A）。EdU实验分析显示，缺氧24小时后EdU阳性细胞的比例显著降低（Figure1B-C）。此外，CMECs细胞的迁移、侵袭及血管形成能力在缺氧条件下亦显著降低（Figure1B, D-F）。综上，24小时缺氧抑制心脏微血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成能力。

m6A点斑实验表明缺氧使得CMECs中m6A丰度显著降低（Figure 1G）。而RT-qPCR实验发现甲基转移酶WTAP和去甲基化酶ALKBH5在缺氧损伤后其mRNA水平显著上调（Figure 1H），但在缺氧CMECs中，只有m6A去甲基化酶ALKBH5的蛋白水平表达显著上调（Figure1I -J）。

二、ALKBH5过表达加剧了缺氧诱导的巨细胞的细胞功能障碍

接下来，作者通过一系列的实验检测缺氧诱导的ALKBH5是否影响CMECs血管生成。首先在常氧和低氧的CMECs模型中建立ALKBH5过表达模型（Figure 2A）。m6A斑点实验显示，在缺氧和常氧条件下，ALKBH5过表达后m6A丰度降低（Figure 2B）。此外，ALKBH5的过表达降低了缺氧条件下的CMECs增殖（Figure 2C-E）、迁移和侵袭（Figure 2F-I）及血管生成能力（Figure2J-K），但是对常氧条件下的细胞无影响。综上，ALKBH5的上调严重加剧了缺氧条件下的CMECs功能障碍，从而导致血管生成受损。

三、ALKBH5敲低降低了CMECs缺氧诱导的功能障碍

首先，在常氧和缺氧条件下，建立ALKBH5敲低模型（Figure 3A）。m6A斑点实验发现，常氧和缺氧条件下，ALKBH5的敲低显著均提升了整体m6A水平（Figures 3B）。但是，仅在缺氧条件下增强了细胞的增殖（Figures 3C-E）、迁移和侵袭（Figures 3F-I）以及血管形成能力（Figures 3J-K）。在常氧条件下，ALKBH5的敲低不影响上述细胞功能。综上，ALKBH5的敲低在防止缺氧诱导的内皮血管生成损伤方面起着关键作用。

四、MeRIP-seq与RNA-seq联合发现了ALKBH5潜在的靶基因

以上结果已经表明，ALKBH5与缺氧诱导的内皮血管生成密切相关，对ALKBH5敲降后，通过MeRIP-seq与RNA-seq方法进行检测，MeRIPseq共发现12783个共有峰，对照组477个独特峰，ALKBH5敲降CMECs中2358个独特峰。此外，发现了771个低甲基化峰和1072个高甲基化峰（Figure 4A），MeRIP-seq进一步揭示了峰的分布特征（Figure 4B）和差异甲基化mRNA峰值的百分比（Figure 4C）。基于这些数据，对两个CMECs组进行了具有代表性的motif分析(Figure 4D)。富集基因差异表达分析显示，1352个基因表达下调，2914个基因表达上调(Figure 4E)，C型利钠肽和FBXW5分别为低甲基化和高甲基化的代表(Figure 4F)。对这些基因进行了GO分析，发现低甲基化转录本的富集主要参与细胞周期和RNA代谢等过程，而高甲基化转录本主要富集于血管新生和细胞增殖调控(Figure 4G)。POSTAR、血管生成数据库、MeRIP-seq 数据和RNA-seq 数据得到，ALKBH5的靶基因能调节血管生成。从中选出的SKP2、WNT5A、FGF18可能是ALKBH5促血管生成的靶基因（Figure 4H），故后续对它们进行进一步研究。

五、ALKBH5调控WNT5A mRNA的稳定性和衰减情况

MeRIP-seq数据显示，敲除ALKBH5后，SKP2、WNT5A和FGF18的m6A丰度显著增加（Figure 5A-B），RT-qPCR和Western blot分析得到，沉默ALKBH5，WB和QPCR的实验表明，WNT5A表达增高，但SKP2和FGF18表达变化不明显（Figure 5C-D），故后续选择WNT5A来进行研究。因为mRNA m6A的内部修饰对靶基因存在mRNA的稳定性和衰减存在影响，所以采用放线菌素D来检测WNT5A mRNA的稳定性和衰减情况，添加放线菌素D之后，WNT5A表达呈时间依赖性降低，敲除 ALKBH5能显著延迟WNT5A mRNA的降解，从而延长了其半衰期（Figure 5E）。进一步发现，ALKBH5过表达显著降低了WNT5A的蛋白和mRNA表达水平、缩短了WNT5A mRNA的半衰期并降低了其稳定性（Figure 5F-H）。而且，通过一系列细胞生物学实验发现，WNT5A激动剂可以显著逆转过表达ALKBH5对CMECs增殖、迁移、血管形成的抑制作用（Figure 5I-L）。

以上结果得到，ALKBH5通过去除转录后的m6A修饰，促进WNT5A mRNA的衰变，降低其半衰期，从而影响缺氧条件下CMECs的生物学功能。

六、ALKBH5过表达减弱小鼠后肢缺血造成的小鼠缺血损伤后的血流恢复和血管生成作用

作者建立了小鼠后肢缺血模型，然后检测ALKBH5在模型中一段时间的表达情况。结果所示，ALKBH5随着时间的推移呈动态变化，在6小时以内，呈增高趋势，缺血后1-21天时，呈降低趋势，到28天时，ALKBH5的表达已回复至缺血前。为了研究ALKBH5在体内对缺血血管生成的影响，在小鼠后肢缺血前4周，通过AAV注射小鼠腓肠肌，使ALKBH5持续过表达（Figure 6A）。数据显示，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白显著上调（补充数据加Figure 6B），在过表达ALKBH5的情况下，m6A丰度显著降低（Figure 6C），通过激光多普勒超声扫描系统后肢缺血后的血流恢复情况发现，与对照组相比，过表达ALKBH5