在分子实验中，想要快速批量验证目标核酸或蛋白的表达水平，Dot blot（斑点印迹）是很多科研人员的优选方案。省去电泳分离步骤，直接点膜孵育检测，兼顾便捷性与可靠性，尤其在 RNA m6A 甲基化、蛋白半定量初筛等热门方向使用频繁。本文将带您了解 Dot blot 实验原理、操作要点、常见问题以及普拉特泽生物 Dot blot 技术服务优势。
操作步骤：
（1）减取适当大小的PVDF膜，于甲醇活化1分钟。
（2）将活化后的PVDF膜于ddH2O中，在脱色摇床上清洗15分钟。
（3）提前预冷离心机，将样品在4℃低温条件下8000 rpm离心15分钟，取上清作为样品（分泌型蛋白）。
（4）取出活化后的PVDF膜在室温晾至半干，看见水膜消失即可。将收集的上清、空白对照、阳性对照分别取5 μl点样至PVDF膜上，风干。室温待样品吸收，样品吸收后点样处颜色加深。
（5）封闭：待PVDF膜上样品完全干燥后，于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭，37℃培养箱孵育2h或者4℃过夜孵育。
（6）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分钟。
（7）一抗孵育：用含5%脱脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀释比稀释一抗，37℃培养箱孵育2h或4℃过夜孵育。
（8）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分钟。
（9）二抗孵育：用含5%脱脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀释比稀释二抗，37℃培养箱孵育1.5 h。
（10）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分钟。
（11）曝光：用滤纸吸干PVDF膜上的TBST溶液，滴加ECL超敏显色剂（A液：B液=1：1），提前将化学曝光仪预冷，进行曝光，观察并记录结果。
注意事项：
（1）在整个操作过程中，手不能直接接触PVDF膜，以免蛋白污染或造成蛋白降解。
（2）脱脂奶粉封闭一定要充分，否则容易造成膜与蛋白的非特异性结合，膜上会出现杂点或假阳性，干扰试验结果。
（3）一抗浓度与二抗浓度不宜过高，否则容易造成高背景或者杂点。适宜浓度的选择，可以通过不同浓度组合的预试验进行确定。
（4）曝光时，时间的确定应该具体情况具体分析，需要一定的实践经验积累。
（5）ECL超敏发光液需要现配现用。
总的来说，Dot blot 是科研预实验中性价比很高的检测技术，合理设计实验对照组，能够有效提升数据可信度。
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