EMSA 凝胶迁移实验实操细节多，不少科研人员在探针制备、体系配比、电泳跑胶、结果判读环节经常遇到各类问题。本期整理 EMSA 高频疑问，针对性解答实验难点，帮大家快速排查问题，顺利完成实验。
1：EMSA 生物素标记探针，收到合成好的探针后，是否需要变性退火？退火怎么做，可以直接使用吗？
A：单链探针必须退火，不能直接使用。 将两条互补单链探针混合，加入退火缓冲液，置于 PCR 仪中 90–95℃加热数分钟，之后缓慢降温至 25℃，完成双链探针的制备。
2：EMSA 反应体系中，探针与蛋白推荐用量是多少？
A：推荐参考范围：探针 0.1–1 nM，蛋白 1–100 ng，可根据预实验结果微调。
3：预测 motif 序列为 GGATT，靶基因启动子上结合位点互补序列是 CCTAA，探针按照 motif 还是互补序列设计？探针是否选取结合位点上下游 15–20 bp 来设计？
A：探针依据 motif（GGATT）对应的链进行设计；序列覆盖结合位点并向两侧延伸，探针总长度建议20–30 bp。
Q4：EMSA 实验出现探针和空载蛋白发生结合，是什么原因？
A：该现象属于非特异性结合，需要增设对照实验优化体系，降低背景干扰。
5：EMSA 电泳时，下方游离 free-DNA 条带呈波浪状，凝胶整体拱形，使用 6% 非变性胶、0.5×TBE（pH=11）、150V 电泳 90 min，蛋白梯度样本，末两孔分别为空载蛋白与 BSA，怀疑是电源问题？
A：大概率凝胶制备存在问题，优先检查配胶、灌胶流程，而非电源。
6：EMSA 出现泳道堵孔同时伴随条带拖尾，是什么原因？
A：常见原因为蛋白上样量过高，或加样孔内残留杂质。
7：EMSA 发生堵孔，是否需要降低电泳电压来改善？
A：优先减少上样量，这是解决堵孔最直接有效的方式。
8：EMSA 预实验阴性对照的游离探针条带很浅，同一张膜其他泳道探针显色正常，是什么原因？
A：大概率本次转膜操作效果不佳，可重新优化转膜条件再重复实验。
9：EMSA 结合条带与竞争条带位置不一致是什么原因？
A：提示结合位点存在序列差异，导致复合物迁移速率不同。
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