一、项目基本信息
二、生信分析流程
我们对公共数据库(GEO、TCGA等)获得的Count或者进行标准化后的基因矩阵数据进行生物信息分析，包括数据下载和质控和差异基因功能分析。通过质控，以筛选高质量数据做进一步分析。根据项目方案设计情况，筛选目的差异表达基因，后续对差异基因进行GO、KEGG和GSEA富集分析以及PPI网络互作分析。
三、项目分析结果
1.原始数据质量评估
1.1样本表达分布
获得均一化的基因表达矩阵后，我们对不同样品间基因整体表达分布进行可视化，一方面展示基因表达情况，还可以作为一种质量控制手段检查样品情况。
1.2主成分分析
主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是一种利用正交变换将一组可能存在相关性的变量 转换为一组新的互相无关的几个综合变量(即主成分)的统计方法。这种分析方法可以降低数据的复杂性，深入挖掘样本之间的关系和变异大小。利用标准化的表达量对样本进行PCA分析，反映样本重复性，结果 如下PCA图:
注:每个散点代表一个样本，散点的颜色表示不同的分组，样本点分布越靠近，说明样本中基因的表达越相似;反之，样本越远，其整体基因水平差异越大。
1.3差异表达分析
基因表达具有时空特异性，不同试验处理基因表达丰度存在显著的变化，从而调控实现不同的生物学功能，基因的差异表达就是比较两个样本或两组样本之间基因是否存在统计学差异，进而研究解释生物学现象项目中，我们以基因表达矩阵为输入文件，应用R中limma包或EdgeR包进行差异分析。最终显著差异表达基因的筛选标准为:|log2FC>1&P.value<0.05。
Up-regulated:表示实验组相对于对照组，基因表达显著上调
Down-regulated:表示实验组相对于对照组，基因表达显著下调
1.4火山图
为了更形象展示每组样本比较的结果，我们釆用火山图(Volcano-Plots)来展示两个(组)差异基因表 达状态，如下图：
表达模式相似的基因通常具有功能相关性，聚类热图可以反映样本之间的相似性。我们将基因表达量为输入文件。如下的热图分别用所有基因的表达结果进行聚类作图，小于3个样本不展示聚类热图。
基因聚类热图
注:图中横向表示基因的聚类情况，而纵向表示样本的聚类结果，样本或基因在同一个树状分支下，表示它们就越相似。不同位置的色块代表对应位置基因的相对表达量，红色表示该基因高表达，蓝色表示该基因低表达。
2.1GO富集分析
GO(Gene Ontology)是一种标准化的基因功能分类体系，目的在于标准化不同数据库中的关于基因和基因产物的生物学术语，对基因和蛋白功能进行限定和描述。GO具体分为生物学过程(Biological Process,BP)、细胞组分(Cellular Component,CC),分子功能(MolecularFunction,MF)三大类。项目中，我们以差异基因作为输入的基因集，用clusterProfiler包进行富集分析，结果用R可视化。
KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一个整合了基因、通路、疾病等信息的数据库，其核心是通路(Pathway)- 由基因、蛋白质等分子相互作用形成的功能网络(如“PI3K-Akt信号通路”)。KEGG 富集分析的目的是:找到差异基因显著参与的信号通路。通过分析差异基因在KEGG 通路中的分布，我们可以揭示这些基因是否协同参与某一特定生物学通路，进而理解其在生理或病理过程中的分子机制(例如，癌症中异常激活的通路)。我们以差异基因作为输入的基因集，用clusterProfiler包进行KEGG富集分析，结果用R可视化。
Gene Ratio表示差异基因占注释到该通路所有基因的比例，该值越大表示差异基因在该通路中富集的越多;气泡的大小反映差异表达分析中差异基因与该通路基因的重叠情况，气泡越大代表重叠的差异基因越多;bar和气泡的颜色反映通路富集的显著程度，从蓝到红，表示越来越显著。
2.3GSEA富集分析
基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)是一种根据预定义的基因集来统计提供的genelist在两个生物状态之间的一致性和差异性，其目的是发现共有的生物功能或生物特性。GSEA不关注某几个表达发生显著改变的基因，而是整个表达数据在特定功能基因集中的表达一致性，以此来解读数据中蕴含的生物学信息。因此GSEA可以避免差异表达分析中阈值筛选带来的问题。
MSigDB (Molecular Signatures Database)提供预定义基因集，根据蛋自位、性质、功能、生物学意义等性质将基因分为八类，包括 H(hallmark gene sets)，C1 (positional gene sets),C2 (curated gene sets) , C3 (regulatory target gene sets), C4 (computational gene sets), C5ontology gene sets), C6 (oncogenic signature gene sets), C7 (immunologic signature gene sets),C8 (cell type signature gene sets)项目中，我们应用 MSigDB数据库中的已知基因集进行 GSEA显著性检验分析，
GSEA富集分析的过程主要包括三个步骤:
1.计算富集分数(Enrichment Score);
2.评估富集分数的显著水平
3.多重假设检验矫正。
加权基因共表达网络分析 (WGCNA,Weighted correlation network analysis)是用来描述不同样品之间基因关联模式的系统生物学方法，可以用来鉴定高度协同变化的基因集，并根据基因集的内连性和基因集与表型之间的关联鉴定候补生物标记基因或治疗靶点。该分析方法旨在寻找协同表达的基因模块(module)，并探索基因网络与关注的表型之间的关联关系，以及网络中的核心基因。适用于复杂的数据模式，推荐5组(或者15个样品)以上的数据。
免疫浸润分析旨在探讨肿瘤微环境中免疫细胞的分布及其对肿瘤发生、发展和治疗的影响。肿瘤微环境由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞及其他成分组成，其中免疫细胞在调控肿瘤免疫逃逸和抗肿瘤免疫中起着重要作用。通过分析免疫浸润特征，可以揭示免疫细胞的组成及其功能状态，从而为肿瘤的诊断、预后评估和个性化免疫治疗策略提供理论支持。
箱线图与热图
箱线图一一既能展示数据分布特征，又能直观对比组间差异。箱线图的用途:展示每组数据的中位数、四分位范围:展示数据分布的离散程度;展示原始数据点的分布;展示组间差异显著性。箱线图可用于可视化并分析基因在两组或多组条件下的表达量分布。
韦恩图(Venn Diagram)是一种用图形表示集合之间关系的工具。在这里我们可以用于取多个数据集的交集。注意:韦恩图适合表示少量集合(通常2-4个)，过多(如4个以上)会导致图形复杂难辨，可以使用UpSetR图来代替韦恩图。
蛋白质相互作用网络（Protein-ProteinInteractionNetwork,PPI）为我们揭示细胞内蛋白质间的协同工作机制提供了一种直观的图模型。通过构建PPI网络，我们可以识别关键节点（hub蛋白）、划分功能模块，并进一步结合富集分析推断相关生物学功能及疾病机制。
KaplanMeier是一种单因素生存分析，它可用于研究1个因素（如基因表达量）对于生存时间的影响。
生存曲线与X轴有交叉，并不意味着研究对象全部死亡（发生终点事件）。实际上，在生存曲线中，每一个时间点上只要有病人死亡（或者发生终点事件），曲线就会下降一定的幅度。下降的幅度具体有多大，取决于该时间点上病人的死亡例数和后续随访时间（该时间截点以后的时间）病人的样本量。
3.5GO、KEGG个性化分析
弦图（GeneOntologyChordDiagram）是一种用于展示基因功能富集结果的可视化工具，通过弦状连接可以更直观的展示基因与GOterm（如生物过程、分子功能等）之间的关联。
