【应用简介】

RNA pull-down 技术主要用于体外验证 RNA 与蛋白质之间的相互作用。以生物素标记的目的 RNA 作为诱饵，捕获细胞内与之结合的蛋白，结合 WB 验证已知结合蛋白，或结合质谱分析筛选未知结合蛋白，多用于 lncRNA、circRNA 等非编码 RNA 结合蛋白研究，解析 RNA 调控基因表达的分子机制。

【技术原理】

首先标记 RNA（如生物素探针标记 RNA），将其与细胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白质复合物，分离复合物得到蛋白质，通过蛋白免疫印迹（western blot）或质谱（massspectrometry）检测蛋白。

【实验方法】

1、生物素探针标记RNA的制备

2、RNA抽提

3、细胞裂解

4、磁珠预处理

5、RNA与磁珠结合

6、RNA 与蛋白相互作用

7、蛋白的检测

【案例展示】

RNA pull-down+MS质谱结果分析

【技术总结】

1、RNA结合蛋白没有结合

可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）缓冲体系不对；（3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低。

解决方法：（1）增加上样蛋白量；（2）应用低盐体系；（3）加入交联试剂。

2、RNA 降解

可能原因：无核酸酶的环境被破坏，比如RNA提取过程中的试剂及材料等；体外转录的RNA探针降解等。

解决方法：清洗和使用新开的离心管和试剂等；RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度。

3、RNA结合蛋白的亲和力不够

可能原因：结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探针用量不足等。

解决方法：优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等。

4、结合的非特异性高

可能原因：（1）缓冲环境没有优化；（2）缓冲环境严谨性低；（3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。

解决方法：（1）优化孵育时间温度盐浓度等条件；（2）使用严谨性高的缓冲体系；（3）调低RNA探针和样品的比例；（4）提高裂解液的量。

5. WB信噪比高

可能原因：（1）阳性信号率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白没有充分溶解。

解决方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化学发光液；（3）用细胞裂解液预孵一抗；（4）增加样品的量；（5）确定有没有其他可能的结合情况；（6）增加裂解液用量。

注意事项:

1、RIP反应体系中的试剂和抗体中均需保证无RNase；

2、磁珠与带标签的RNA要充分混合，可优化孵育的温度、时间以及RNA的含量等。

【送检标准】

【交付标准】

1、实验报告

2、真实实验结果

3、原始图片

4、实验原始数据

5、剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）