二、生物信息分析流程2.1分析流程
首先我们从公共数据库或实验平台获取单细胞测序数据，经过严格的质量控制、标准化处理和批次效应校正，确保数据可靠性。接着进行特征选择与降维，筛选高变基因并通过 PCA、t-SNE 或 UMAP 等方法将高维数据投影到低维空间。基于降维结果进行细胞聚类与分群，利用 Louvain 等算法将相似细胞划分为不同簇。随后通过细胞注释与标记基因识别，结合已知标记基因和参考数据库确定各簇的细胞类型，并识别特异性标记基因。在此基础上开展富集分析，探索差异表达基因的生物学功能和信号通路。为揭示细胞动态变化，进行拟时序分析重建细胞发育轨迹，细胞通讯分析解析细胞间信号网络，并在肿瘤研究中应用 inferCNV 分析推断染色体拷贝数变异。整个流程从数据到知识，系统揭示细胞异质性、功能状态和互作关
系，为理解组织微环境、发育过程和疾病机制提供多维度视角。
2.2 分析内容
三、项目分析结果
3.1 可视化 QC 指标
我们一般使用这些指标来过滤细胞：过滤具有 UMI 计数超过 2500 或小于 200 的细胞；
过滤具有>5%线粒体的细胞。
各个指标质控小提琴图
注：nFeature_RNA 代表检测到的基因数；nCount_RNA 为总 UMI 计数；percent.mt 线粒体基因百分比。每一个点代表一个个体细胞数据，identity 表示样本。
3.2 筛选高可变辑因
我们计算数据集中显示高变异的特征子集（即，它们在某些细胞中表达强烈，在另一些单元格中表达得很低）。在下游分析中关注这些基因有助于突出单细胞数据集中的生物信号。默认情况下，我们使用每个数据集的 2000 个基因。这些将用于下游分析，如 PCA。
3.2 筛选高可变辑因
我们计算数据集中显示高变异的特征子集（即，它们在某些细胞中表达强烈，在另一些单元格中表达得很低）。在下游分析中关注这些基因有助于突出单细胞数据集中的生物信号。默认情况下，我们使用每个数据集的 2000 个基因。这些将用于下游分析，如 PCA。
高变基因筛选图
注：左图为全部基因分布，黑点代表非高变基因，红点为高变基因。右图为高变基因突出显示，红点代表高变基因，标注为重要高变基因名称。
3.3 可视化 PCA
3.3.1 PCA
Seurat 提供了几个有用的方法来可视化定义 PCA 的单元格和功能，包括[DimPlot()]，[DimHeatmap()]等。
PCA
3.3.2 不同 PC 展示
我们通常选择包含前两个 PC 在内的一系列重要 PC（10-20）用于进一步下游分析。
我们通常选择包含前两个 PC 在内的一系列重要 PC（10-20）用于进一步下游分析。
不同 PC 展示
3.4 确定数据集的“主成分个数”
Seurat 根据 PCA 分数对单元单元进行聚类，每个 PC 基本上代表一个“元结构”，该
“元结构”将信息组合在相关功能集中。我们随机排列数据的子集（默认情况下为 1%）并
重新运行 PCA，构建功能分数的“空分布”，并重复此过程。我们确定“重要”PC。
QQ Plot 和肘部图
注：每个 PC 的 p 值分布与统一分布（虚线）进行比较。“重要”PC 将显示在虚线上方。另一种方法生成“肘部图”：根据每个（函数）解释的方差百分比对原则组件进行排名。在此示例中，我们可以观察到 PC 9-10 周围的“肘部”，表明大多数真实信号在前 10 个 PC 中被捕获。
3.5 细胞聚类及可视化
Seurat 采用基于图形的聚类方法，简言之，这些方法将细胞嵌入到图形结构中，例如 K最近的邻（KNN）图，在具有类似特征表达模式的单元之间绘制边缘，然后尝试将此图划分
为高度互连的“集团”或“社区”。与表象一样，我们首先根据 PCA 空间中的欧几里德距离构建 KNN 图，并根据当地社区的共享重叠（Jaccard 相似性）优化任意两个细胞之间的边缘权重。接下来将 Louvain 算法（默认值）或 SLM 等模块化优化技术应用于迭代组细胞，以优化标准模块化功能。该函数实现此
过程，并包含一个分辨率参数，该参数设置下游聚类的“数量”，增加值导致更多群集。我们发现，将此参数设置在 0.4-1.2 之间通常会为大约 3K 细胞的单细胞数据集提供良好的结果。
对于较大的数据集，最佳分辨率通常会增加。Seurat 提供了多种非线性降维技术，如 tSNE 和 UMAP，以可视化和探索这些数据集。
UMAP 降维散点图
注：9 个簇（Cluster 0-8），对应 9 种细胞类型；每个点代表一个单细胞。UMAP_1 和 UMAP_2 代表细胞类型分离维度
3.6 查找不同表达的 marker
默认情况下，FindAllMarkers()与所有其他细胞相比，可识别单个群集的 marker。
