你上次做Western Blot是多久啦？有没有遇到这样的情况呢？辛辛苦苦做了一天实验，结果曝光显影后，“两眼一黑”，膜背景黝黑发亮！内心还略带不甘，辛苦做了一天实验，就做出这鬼东西！
首先可以清晰的看到目的条带(泛白的部分)，确认是所需的目的条带后，通过膜再生液进行剥离一抗二抗，再重新孵育稀释的一抗二抗，漂洗干净高背景的膜即可，具体根据实际情况而定。相信很多同学及行业朋友都了解Western Blot「高背景膜」的因素有很多，例如: 样品的质量、样品的上样量、封闭不充分、抗体浓度过高、膜选择不当以及漂洗不充分等均有可能产生高背景的膜。下面我们就来学习一下吧！Western Blot膜出现「高背景」大多数情况下是由于封闭这个步骤没有做好，为什么这么说呢？因为常用的封闭液包括5%的脱脂奶粉和BSA(牛血清白蛋白)，它们可以有效阻止非特异性蛋白的结合，提高抗体结合效率。如果封闭不充分，抗体的结合效率可能受到影响，导致特异性结合减少而非特异性结合增加。同时，封闭液的选择需要根据实验的具体情况进行调整。例如: 使用磷酸化抗体时，脱脂牛奶中的络蛋白可能会与抗体发生非特异性结合，导致高背景，此时需要选择其他封闭液(BSA、酪蛋白、明胶、全血清、聚乙烯吡咯烷酮及商品化封闭液)进行封闭。此外，还有抗体的浓度和孵育条件对Western Blot膜「高背景」也有重要影响。当抗体浓度过高时，抗体与膜上的非特异性位点结合的机会增加，从而导致背景信号增强，还可能导致抗体在膜上的过度堆积，使得特异性条带的信号与背景信号难以区分。值得注意的是，低浓度的抗体可以减少非特异性结合，但也可能导致特异性条带的信号减弱，甚至无法检测到。如果不清楚孵育抗体所需的浓度时，建议在实验中做梯度稀释先摸适合的抗体浓度，便于后续的实验或在实验中逐步优化抗体的浓度，并适当延长洗涤时间和次数，以减少非特异性结合。此外，一抗孵育的温度和时间也需要根据实验要求进行调整，通常推荐在4℃下孵育过夜，以减少高背景的产生。还有就是膜选择和处理时，要区分PVDF膜和NC膜，不同的膜具有不同的蛋白结合特性。在操作过程中，切记PVDF膜在使用前需要用100%甲醇完全浸润，确保其均匀湿润，脱去PVDF膜上的油性物质，避免高背景的产生。同时在实验过程中应保持膜的湿润状态，防止干燥导致的背景增加。 总而言之，WB 膜上背景发黑是实验中非常常见的综合性问题，根源往往并不单一，膜、封闭液、抗体浓度、洗涤、曝光条件任一环节都可能造成非特异性结合。排查背景时建议遵循从易到难的思路，优先优化封闭与洗涤条件，再依次验证一抗二抗浓度与孵育方式，减少无效试错。
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