冰冻切片免疫荧光是组织水平蛋白定位、共定位观察的常用技术，保留组织抗原性，直观看到目标蛋白在组织中的表达位置与表达量，很多小伙伴做实验时经常会遇到非特异染色、荧光淬灭、信号弱等问题。 今天普拉特泽生物给大家整理了一套实操版冰冻切片免疫荧光染色步骤，科研人可以直接收藏参考👇
冰冻切片免疫荧光染色操作步骤
1️⃣ 样本取出 从‑80℃冰箱中取出冰冻实验样本。
2️⃣ 样本固定 待样本稍微融化，放入 4% PFA 中固定 15 分钟。
3️⃣ 洗涤 蒸馏水洗 3 次，每次 5‑10min。
4️⃣ 画圈 + 封闭 用免疫组化笔将组织样本圈出；滴加含 4% BSA+1% Triton 的封闭液封闭 1h。
小提示：时间充裕可延长封闭；实验来不及，可置于 4℃冰箱过夜封闭。
5️⃣ 一抗孵育 回收封闭液，滴加一抗。优选 4℃过夜孵育；赶实验进度可 37℃培养箱孵育 2h 加速反应。
6️⃣ 洗涤一抗 回收一抗，蒸馏水洗 3 次，每次 5‑10min。
多标实验小技巧：若需要孵育 2 种及以上一抗，此步不洗涤，依次 37℃孵育 2h，全部一抗孵育结束后再统一洗涤。
7️⃣ 二抗孵育⚠️自此步全程避光 滴加荧光二抗，37℃生物培养箱孵育 1h。
重点：荧光二抗对光敏感，从本步骤开始所有操作必须避光，防止荧光淬灭。
8️⃣ 洗涤二抗 回收二抗，蒸馏水洗 3 次，每次 5‑10min。
多标实验：多种二抗可混合共孵育；分开孵育操作逻辑参照多一抗孵育方式。
9️⃣ 复染核 + 封片 ▪使用含 DAPI 抗淬灭剂：直接滴加，指甲油封边即可。 ▪单独 DAPI 试剂：DAPI 孵育 3‑5min，回收试剂，蒸馏水洗 3 次，每次 5min；再滴加抗淬灭剂，指甲油封边。
🔟 样本保存 封片完成后玻片避光，‑20℃冰箱暂存，尽快上机荧光显微镜拍摄。
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