在完成样本制备、蛋白定量后，WB实验正式进入核心分离阶段。很多科研人员前期样本处理无误，却卡在制胶不均、电泳条带歪、转膜不全、蛋白跑飞等问题。普拉特泽生物依托多年WB项目实操经验，标准化打磨制胶、电泳、转膜全流程参数，完美解决条带弯曲、弥散、转膜失效、大小蛋白转印不均等常见问题，为后续抗体孵育、显色成像打好坚实基础。
承接上篇内容，本篇详细拆解WB中段三大核心步骤：配胶、电泳、转膜，手把手理清操作逻辑与避坑要点。
一、分层制胶：分离胶+浓缩胶各司其职
WB凝胶分为下层分离胶、上层浓缩胶，两层胶功能完全不同。分离胶起到分子筛作用，根据蛋白分子量大小实现精准分离，大分子蛋白迁移慢、小分子蛋白迁移快；浓缩胶可以将所有样本压缩至同一水平，让所有蛋白“同步起跑”，保证条带整齐、平整、无拖尾。
制胶过程需严格把控配比、凝固时间，避免凝胶厚薄不均、气泡残留，防止后续电泳条带歪斜、断裂、局部弥散。
二、蛋白变性与电泳：规范跑条带
上样前样本需高温变性：加入上样缓冲液后100℃煮沸5-10min。高温彻底打开蛋白空间构象，结合SDS使蛋白均匀携带负电荷，让蛋白迁移速率只由分子量决定，排除空间结构干扰，保证分离结果精准。
电泳采用经典先低压、后高压模式：浓缩胶阶段80V低压慢跑，防止样本扩散；进入分离胶后调整为120V高压分离，结合预染Marker，精准判断目的蛋白分子量位置，实现高效、规整的蛋白分离。
三、冰浴转膜：完整保留目的蛋白
电泳结束后立即进行转膜操作，PVDF膜提前用甲醇活化，按照标准“黑胶白膜”顺序组装转膜夹，全程冰浴、200mA恒流转膜。转膜全程产热较高，冰浴环境可有效降温，避免凝胶变形、蛋白降解、转膜过度/转膜不全，保证大、小分子量蛋白均可稳定转印至膜上，最大程度保留样本中的目的蛋白。
至此，蛋白分离与转印工作全部完成，膜上已经完整留存样本蛋白。下一篇我们将讲解最后一步：封闭、抗体孵育、ECL显影，搞定条带显色、杜绝背景杂带！
普拉特泽生物可全程承接WB制胶、电泳、转膜全套实验操作，标准化参数规避各类实验bug，无需自己反复摸索条件，高效产出干净、规整、可用的WB实验结果。
