经过前两篇的样本制备、蛋白定量、电泳转膜，WB实验来到最后出图关键阶段。很多实验前期操作完美，却最终败在背景过高、杂带满天飞、目的条带极弱、无信号、非特异性结合严重等问题。普拉特泽生物针对WB后期显色成像难点，优化封闭体系、孵育时长、洗膜参数与曝光条件，有效降低背景噪音、提升特异性信号，交付高清晰度、高可信度的WB条带图片。
承接上篇转膜完成的实验流程，本篇一次性讲完WB收尾全流程：封闭、一抗二抗孵育、洗膜、ECL发光显影。
一、封闭：从根源降低背景干扰
转膜后的PVDF膜存在大量空白吸附位点，极易非特异性结合抗体，造成高背景。常规蛋白采用5%脱脂奶粉封闭，室温封闭1-2h或4℃过夜；磷酸化蛋白严禁使用奶粉，需更换3%BSA封闭，避免奶粉中酪蛋白干扰磷酸化位点检测，杜绝假阴性、背景脏等问题。
二、抗体孵育：特异性识别+信号放大
封闭完成后进行一抗孵育，4℃摇床过夜孵育，低温长时间结合可大幅提升低丰度蛋白、弱表达蛋白的结合效率，最大程度捕捉微弱目的信号。孵育结束后用TBST充分洗膜，彻底洗去未结合游离一抗，减少非特异性残留。
随后进行HRP标记二抗室温孵育，二抗特异性结合一抗，通过酶促反应实现信号放大，让原本微弱的蛋白信号可以被仪器识别捕捉，孵育完成后再次充分洗膜，保障膜面干净无残留。
三、ECL发光显影：成像出图
最后进行化学发光显色，将ECL发光液A、B液1:1新鲜配比混匀，均匀覆盖膜面孵育。依托HRP催化鲁米诺底物发光原理，目的蛋白区域特异性发光，蛋白表达量越高、信号越强、条带越清晰。最后通过凝胶成像仪梯度曝光拍照，筛选最优成像结果，得到干净、无杂带、对比度佳的标准WB条带。
普拉特泽生物WB一站式服务，覆盖蛋白提取、定量、制胶电泳、转膜、封闭孵育、发光成像全流程，团队常年处理各类疑难样本、低丰度蛋白、磷酸化蛋白检测项目，有效解决无条带、弱信号、高背景、杂带、拖尾等所有常见问题。实验结果稳定可重复，图片质量高，完全满足课题结题、期刊发表使用需求，助力科研人员高效出成果、快速发文章！
