EMSA 探针为双链寡核苷酸，核心目的是特异性结合 DNA 结合蛋白（转录因子、表观蛋白等），整套实验必须配套野生标记探针、冷竞争探针、突变探针三组序列，缺一不可。
1、定位转录因子的核心结合位点：探针是以启动子区的DNA序列为依据，要包含转录因子的结合位点，可以用生物信息学工具来预测
2、野生型序列探针设计标准：
长度一般在25-40bp，太短导致蛋白质结构不稳定，太长容易形成发夹、二级结构；
CG含量在40%-60%，Tm值统一在60-70℃；
实验室一般首选生物素标记，正义链 5' 端单标记 / 双链双标记，也可以用p32或者地高辛来标记。
3、三套必须的对照探针是设计：
冷竞争探针设计：序列完全和野生型的一致，阳性判定：过量冷探针可完全压制滞后条带，证明结合特异。
突变探针设计：只改变核心的保守碱基，两侧的保护碱基不动，替换原则：A↔T、G↔C，不单纯删除；一次突变 3–4 个关键保守碱基（别只改 1 个，容易仍弱结合）。
无关阴性探针：随机无关双链 DNA，无该 TF 结合位点，排除蛋白非特异性吸附核酸。
4、探针合成与退火的制备要点：
- 合成级别：生物素修饰必须HPLC 纯化，去除游离生物素杂质，否则背景爆炸；普通冷探针 PAGE 纯化即可
- 退火体系（通用）
- 正义链：反义链 = 1:1 等摩尔混合
- 退火缓冲液：10 mM Tris pH7.5、50 mM NaCl、1 mM EDTA
- 程序：95 ℃ 5 min → 以 0.5–1 ℃/min 缓慢降温至室温，分装 - 20 ℃避光保存
- 工作浓度：标记探针终浓度常用10–50 fmol / 反应
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