首页 文章资讯 技术文章

EMSA 凝胶迁移实验超详细实验教程

2026-06-12

来源/作者：普拉特泽生物-医学整体课题外包


做转录调控的小伙伴谁能躲过EMSA！明明步骤照着做，却总遇到无滞后条带、杂带满天飞、结合结果假阳性的问题？蛋白-DNA结合搞不懂、实验反复翻车，大概率是没吃透核心原理和标准操作流程！今天就带你们详细掌握EMSA实验原理+类型+实验步骤+结果判读~

一、EMSA的实验原理  

主要用于体外验证蛋白质与DNA/RNA的结合情况，常用于转录因子与启动子的互作验证。将纯化的蛋白或细胞粗提液和带标记的DNA探针一同孵育，通过非变性的聚丙烯凝胶电泳进行分离复合物和非结合的探针。其中DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢，而探针移动的较快，以此来判断蛋白与核酸之间是否存在相互作用。



二、EMSA的实验类型

验证型EMSA

用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。将结合位点突变，以突变探针为对照，野生型探针出现迁移条带，而突变探针未出现迁移条带，则说明该探针含有可与蛋白质结合的位点。

竞争型EMSA

探针序列不变，不含修饰基团的探针称为冷探针。冷探针与标记探针竞争性地与蛋白结合，冷探针不显影出迁移条带。以冷探针为对照，标记探针出现迁移条带，而冷探针迁移条带减弱或消失，则排除了假阳性干扰，增加实验结果准确性。

超迁移 EMSA

使用目标蛋白的特异性抗体，蛋白-探针复合物被抗体识别并结合，该三聚复合物在凝胶电泳中，迁移速率再次增大，出现在蛋白-探针复合物的上方的超迁移条带，验证了探针与目的蛋白的特异性结合。

三、EMSA的实验步骤

1、探针设计、合成、标记

  • 设计双链 DNA 探针：截取含预测结合位点的 20–40 bp 序列，同时合成野生型、突变型上下游单链；
  • 退火成双链：等量上下游单链混合，95℃5 min，梯度缓慢降温至室温；
  • 生物素末端标记（商业化试剂盒一步标记）；标记探针 - 20℃避光保存，1 个月内使用最佳。

    • 2、蛋白样品制备 

  • 样品类型：
    • 核蛋白提取（细胞 / 组织，适合内源转录因子）；
    • 体外纯化重组蛋白（高纯度，背景低）；
  • BCA 定量蛋白浓度，冰上分装，避免反复冻融；全程无核酸酶污染（枪头、水、离心管均无 DNase/RNase）。

    • 3、凝胶电泳

     配制非变性聚丙烯酰胺凝胶、冰上制备反应体系、电泳分离

    4、转膜、发光显影

  • 提前泡膜：尼龙膜、滤纸浸入 0.5×TBE 转膜缓冲液 10 min；
  • 转膜夹层顺序（由下至上）：海绵→滤纸→凝胶→尼龙膜→滤纸→海绵，全程无气泡；
  • 恒压 30 V，转膜 30–40 min；保证蛋白 - 核酸复合物完整转移至膜上。
  • 交联：膜 DNA 面朝上，紫外交联仪 120 mJ/cm² 照射，将探针共价固定在尼龙膜；
  • 封闭：封闭液室温封闭 30 min；
  • 孵育链霉亲和素 - HRP（结合生物素），洗膜；
  • 加 ECL 发光液，凝胶成像系统曝光拍照、条带分析。

    • 四、结果判读

  • 阴性对照：只有一条快速迁移的 Free 探针条带，无滞后带；
  • 实验组：出现 1 条 / 多条位置靠后的 Shift 滞后条带，证明存在蛋白 - DNA 结合；
  • 野生冷竞争：Shift 条带明显减弱 / 消失；突变竞争：Shift 条带几乎不变→序列特异性结合；
  • Supershift 组：原 Shift 条带消失，出现更靠上的超迁移条带→直接证实结合蛋白为目标转录因子。
          熟练掌握EMSA的实验逻辑与标准化操作，是做好转录调控研究的基础。精准把控凝胶配制、孵育条件、电泳转膜等关键步骤，规范设置对照体系，才能得到真实、可靠的实验数据。后续会持续更新科研实验干货，助力大家高效搞定课题实验！如果有其他医学科研实验外包的需求，欢迎随时咨询：18570028002哦~

    • 上一篇

    CO-IP实验结果解读

    下一篇

    EMSA凝胶迁移实验的探针设计以及实验解读

    相关文章

    现在咨询 了解详情