蛋白与蛋白之间的相互作用，是调控细胞信号通路、生命活动的核心环节。在科研探索的道路上，找到高效、稳定验证蛋白互作的实验方法，是众多研究者的刚需。酵母双杂交 (Y2H) 作为经典的体内互作验证技术，凭借操作成熟、结果直观的优势，至今仍是筛选与验证蛋白互作的首选方案。今天普拉特泽生物就带大家完整拆解酵母双杂交的实验原理与标准化操作流程。
🔬酵母双杂交核心实验原理
酵母双杂交技术本质是通过报告基因的表达检测蛋白‑蛋白相互作用。 该实验利用真核转录因子可拆分的特性，将转录因子的DNA 结合域（BD） 和转录激活域（AD） 拆开：
- 将诱饵蛋白（Bait）与 BD 融合；猎蛋白（Prey）与 AD 融合，分别构建载体；
- 两个载体单独存在时，BD、AD 相互分离，无法激活下游报告基因；
- 若诱饵蛋白和猎物蛋白发生相互结合，BD 与 AD 就会被拉近、重新组装成完整的转录激活因子；
- 重组后的转录因子结合 UAS 序列，启动下游报告基因（HIS3、ADE2、LacZ 等）转录；
- 最终酵母菌株可在筛选平板生长，或是产生显色信号，以此证明两个蛋白存在互作关系。
📋标准化实验操作全流程
一、酵母转化
转化前预处理 Carrier‑DNA：95℃金属浴加热 5 min，迅速置于冰上冷却。Carrier‑DNA 可保护质粒，抵御酵母内源 DNA 酶的降解。
- 取 25 μL Y187（AD 载体菌株）、Y2HGold（BD 载体菌株）酵母感受态细胞；
- 依次加入预处理 Carrier‑DNA 2.5 μl、PEG/LiAc 溶液 125 μl，充分吹打混匀；
- 加入 100‑1000 ng 重组质粒，30 ℃水浴 30 min；
- 42 ℃热激水浴 15 min，热激期间轻柔颠倒离心管，防止菌体沉淀。
💡原理小科普：PEG 促进质粒 DNA 附着酵母细胞膜，LiAc 提高酵母细胞壁通透性，共同提升转化效率。
二、菌体清洗涂布单缺平板
- 5000 rpm 离心 40 s，弃去上清；
- 400 μL 无菌水重悬菌体，再次离心洗涤；
- 无菌水重悬沉淀，取菌液涂布单缺筛选平板：AD‑Y187 涂布‑Leu 平板；BD‑Y2HGold 涂布‑Trp 平板；
- 28 ℃恒温培养 48‑96 h，直至长出单菌落。
三、单克隆挑选‑菌株交配
- 挑取长势饱满的单菌落，接入对应单缺液体培养基：SD‑Leu 培养 AD 菌株、SD‑Trp 培养 BD 菌株，28 ℃摇床过夜培养；
- 将 AD、BD 菌液依次点到 YPDA 交配平板上，两个菌圈部分重叠；
- 28 ℃培养 12‑16 h，挑取重叠区域菌体，即为交配成功的二倍体菌株。
四、二缺恢复培养 & 梯度稀释点板
- 挑取交配菌体，接入 500 μL 二缺（‑Leu‑Trp）液体培养基，28 ℃培养≤48 h；
- 无菌水对二倍体菌液做梯度稀释，配置 10⁻¹~10⁻⁶一系列稀释样品；
- 将不同稀释梯度菌液，依次点板到DDO（双缺）、TDO（三缺）、QDO（四缺） 筛选平板；
- 28 ℃恒温培养 3‑5 天后，观察菌落生长状态。
📊实验结果判读指南
✅ DDO 双缺平板：实验组、阳性对照均长出菌落，证明酵母二倍体交配成功，载体正常转入酵母，实验体系无问题。 ✅ TDO 三缺 / QDO 四缺平板：阳性对照菌落正常生长；待测样品长出菌落，说明诱饵蛋白与猎物蛋白存在相互作用；阴性对照无菌落生长。 ✅ 蓝白斑筛选（X‑α‑Gal）：菌落呈现蓝色，进一步佐证蛋白互作，排除假阳性结果。 ✅ 梯度稀释强度判断：高稀释倍数条件下仍有菌落生长 → 强相互作用；仅低稀释浓度长菌落 → 弱相互作用。
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