细胞迁移是肿瘤侵袭转移、伤口愈合、炎症反应等众多生物学过程的核心环节，Transwell 小室迁移实验是体外检测细胞迁移能力最经典、最常用的实验方法。 很多小伙伴初次上手 Transwell 实验，常常遇到细胞穿膜过少、膜被戳破、染色背景脏、计数结果偏差大等问题。今天普拉特泽生物就为大家带来一份保姆级 Transwell 迁移实验完整操作教程，从前期准备到镜下拍照读数全覆盖
一、实验前期准备工作
- 提前配制两种培养基：正常完全培养基（10% 血清 + 1% 双抗）、低血清培养基（1% 血清 + 1% 双抗）。利用上下小室血清浓度差，构建趋化迁移环境。
- 准备全新 24 孔板以及 Transwell 小室；在 24‑well 板下室中加入 600μL 含 10% 血清的完全培养基。
- 将 Transwell 小室轻轻放入 24 孔板内，保证小室底部膜的底面完全接触下层培养基，切记不要产生气泡，气泡会阻隔细胞迁移。
- 胰酶消化待检测细胞，使用低血清培养基重悬细胞，充分吹打制备均匀的细胞悬液，完成细胞计数备用。
二、细胞接种与培养孵育
- 下室（24 孔板孔内）：加入 500‑600 μL 含 10% FBS 的完全培养基，作为趋化诱导液；
- 上室（Transwell 小室内部）：垂直缓慢滴加 200 μL 使用 1% 低血清培养基配制好的细胞悬液； 轻轻晃动 24 孔板使细胞分布均匀，放入细胞培养箱，按照对应细胞特性孵育适宜时间，让细胞向着高血清方向发生穿膜迁移。
💡小提示：上室采用低血清培养基，减少血清本身对细胞增殖的干扰，实验结果更偏向迁移能力，而非细胞增殖带来的数据误差。
三、固定与结晶紫染色
孵育结束后取出 24 孔板，开始染色步骤：
- 弃去上下室液体，小室内部加入 4% 多聚甲醛，室温条件下固定 15‑30 min；
- PBS 溶液舀洗小室 2 次，洗去残留固定液；
- 将小室浸入 0.1% 结晶紫染液中，室温染色 10‑20 min；
- 使用清水舀洗小室，冲掉多余的浮色染液，降低后续拍照背景杂质。
✅清洗小室小技巧：清洗动作就如同用小室 “舀水”，浸入洗液中反复几次即可，不要大力冲淋。
四、棉签擦拭去除上室残留细胞（最关键易错步骤！）
膜上层没有穿过去的细胞必须擦除干净，不然拍照时上层细胞会严重干扰视野计数结果：
- 准备一头圆一头尖的棉签；先用棉签圆头面轻轻擦拭小室上表面，力度轻柔，千万不要戳破 PET 膜；
- 再使用棉签尖头部位，清理干净小室边缘残留细胞；
- 清水再次漂洗小室，将擦拭掉落的细胞残渣冲洗干净；
- 将处理好的小室放在干净台面，室温自然晾干。
五、显微镜拍照观察与数据统计
晾干后的 Transwell 小室就可以上机观察啦！ 可以将小室倒扣放置在载玻片上，也可直接放置在 24 孔板盖子上，置于倒置显微镜下观察。 随机选取 5‑10 个互不重叠的视野进行拍照，统计每个视野下成功穿过膜的细胞数量，最后计算各组视野细胞数平均值，即可对比不同组别细胞的迁移能力差异。
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