普拉特泽生物分子实验平台：深耕转录调控、蛋白核酸互作方向，承接 EMSA、ChIP、双荧光素酶等全套分子机制实验外包，助力科研人员高效完成转录因子结合验证，加速课题推进与论文产出。
EMSA（electrophoretic mobility shift assay，凝胶迁移实验）是验证蛋白质与 DNA/RNA 核酸序列相互作用的经典体外实验，广泛应用于转录因子靶序列验证、结合基序鉴定、蛋白互作调控核酸结合能力等分子机制研究，是转录调控、表观、肿瘤代谢课题中高频使用的核心实验技术。
🔬 一、EMSA 实验基本原理
将纯化蛋白或细胞核提取液，与标记后的 DNA 探针共同孵育，再使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样本。
蛋白与探针结合形成的蛋白‑核酸复合物分子量更大，电泳迁移速率更慢，条带位置滞后（shift 条带）；未结合蛋白的游离探针（free probe）迁移速度更快，跑在凝胶下方。根据滞后条带，即可判定蛋白与核酸是否存在相互作用。
根据实验目的，EMSA 主要分为 3 种类型：
- 验证型 EMSA：直接验证目标蛋白与 DNA 探针能否结合，基础验证实验；
- 竞争型 EMSA：加入过量未标记冷探针，若特异性结合条带减弱 / 消失，证明结合具有序列特异性；还可搭配突变探针，确定核心结合碱基；
- 超迁移 EMSA（Super‑shift）：体系加入目标蛋白特异性抗体，抗体‑蛋白‑DNA 形成三聚复合物，条带进一步向上迁移，确认复合物中的目标蛋白。
🧪 二、全套标准实验流程
1. 实验方案设计（分组规划是成功第一步）
正式实验必须设置完整对照，常规分组包含：阴性对照（仅标记探针）、实验组（蛋白 + 标记探针）、冷探针竞争组、突变探针对照组、超迁移抗体组。
可实现三大研究目的：验证蛋白‑DNA 结合、定位 DNA 核心结合基序、研究互作蛋白对该结合的调控效应。
2. 生物素标记 DNA 探针制备
常用标记方式：生物素、地高辛、同位素、荧光标记，生物素标记配合化学发光检测是目前主流方案。
- 合成上下游单链 DNA 探针（5’端带生物素标记）；
- 用 TEN 缓冲液稀释引物至 1 μM，95℃加热 10 min，室温自然冷却退火，形成双链探针；
补充方案：长片段探针可构建载体，使用通用标记引物 PCR 扩增制备，降低合成成本；探针一般无需纯化，结果不佳时可采用乙醇沉淀或试剂盒纯化，使用琼脂糖 / PAGE 胶检测探针纯度。
3. 蛋白质纯化 / 细胞核蛋白提取
样本可选：体外原核 / 昆虫细胞表达纯化重组蛋白、细胞细胞核裂解液
✅ 关键注意事项：
- 全程低温操作，保护蛋白天然构象与活性，避免蛋白降解；
- 严格设置空载蛋白对照（如 GST 标签蛋白），排除标签干扰；
- 提取液盐离子、杂质偏高时，使用分子筛置换缓冲液。
4. 蛋白‑DNA 结合孵育（10 μL 标准体系）
✅ 孵育程序：室温 20‑25℃，先加入蛋白、冷探针 / 抗体预孵育 10 min，再加入标记探针，继续室温孵育 20 min；孵育完成后可加入无色上样缓冲液混匀准备电泳。
5. 4% 非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（20 mL 体系）
⚠️ 重点：全程禁止 SDS，无浓缩胶，仅一块分离胶，制胶模具彻底清洗，去除 SDS 残留！
加入 TEMED 后快速混匀，立即灌胶，避免凝固产生气泡。
6. 电泳操作
- 预电泳：0.5×TBE 电泳液，4℃，100V 预电泳 15~30 min，更换预冷电泳液；
- 上样：取反应产物上样，预留泳道加入溴酚蓝指示电泳进程；
- 正式电泳：4℃低温环境，恒压 100V 电泳 40~60 min，溴酚蓝指示剂跑至凝胶 1/4 处停止电泳，防止小分子游离探针跑出胶外。
7. 转膜、紫外交联
- 尼龙膜提前用 0.5×TBE 浸泡 10 min，剪角标记膜正反面；
- 湿法转膜：0.5×TBE 作为转膜液，恒压 100V（380mA），4℃转膜 30~60 min；
- 紫外交联：膜样品面朝上，120 mJ/cm² 交联 45~60 s，使 DNA 固定在尼龙膜上。
8. 化学发光显影检测（生物素探针）
- 封闭：封闭液室温封闭尼龙膜 15 min；
- 孵育：Streptavidin‑HRP 稀释工作液，室温摇床孵育 15 min；
- 洗涤：洗涤缓冲液洗膜 4 次，每次 5 min；平衡缓冲液平衡 5 min；
- 显色：现配 ECL 发光工作液，均匀覆盖膜表面，室温孵育 2~3 min；
- 成像：X 光胶片压片或化学发光成像仪采集条带结果。
❌ 三、EMSA 高频问题排查
- 无滞后迁移条带 蛋白降解 / 蛋白活性不足；探针设计或标记失效；转膜、交联效率低；曝光成像时间不足。
- 背景杂带高，非特异结合严重 曝光时间过长；封闭不充分；洗膜次数不足；实验全程尼龙膜干燥。
- 复合物条带卡在加样孔 胶浓度、缓冲液离子浓度不合适；蛋白与探针配比失衡、上样量过大；可优化电泳电压、体系 pH。
