GST Pull-Down实验结题报告（案例展示版）
2026-07-09
来源/作者：普拉特泽生物-医学整体课题外包
很多课题组在自建实验体系时，常遇到诱饵蛋白不溶、挂珠效率低、杂带严重、无互作信号、假阳性高等问题，反复返工严重耽误课题进度。
本期分享普拉特泽生物真实GST Pull-Down结题案例，完整展示从蛋白表达、纯化、体外互作孵育到WB检测的全套！
一、实验目的
通过GST pulldown实验验证****与****细胞裂解液中****之间相互作用。
二、实验样本及分组
2.1 实验样本
序号 | 名称/标记 | 样本类型 | 样本数量 | 样本来源 |
1 |
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3 |
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三、实验结果
图1 ****蛋白和细胞裂解液pull down结果图（上图为案例图）
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关于统计分析说明：
① 如样本未设置平行样本，或无独立生物学重复样本，则默认不做统计学分析。
② 如样本设置了3个以上平行样本，则分析时取该样本各平行样本的均值及标准差。
③ 如组内有多个样本，且每个样本设置有3个以上平行样本或3次以上独立生物学重复样本，则分析时取每个样本各平行样本的均值及标准差，或以组内样本间的标准差进行统计。
常用统计学方法：
① 仅有2组间的均值比较：独立样本t检验 (Student’s t test)
② 两个及两个以上样本均数差别的显著性检验：方差分析 (ANOVA)
*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001
请注意：因无法获知样本来源、处理、数量、极值含义等信息，我司提交的统计学分析结果仅供参考。如有需要，请根据您的研究方案移步本文件夹中的Graph Pad文件，获取您本次检测结果的原始数据，进行个性化分析。
四、实验结论
*****（补充完整相应的实验结论）
请注意：因无法获知研究背景及研究方案，我司提交的结果说明仅针对该次检测结果进行客观描述，所下结论仅供参考。请合理判断该检测结果的可用性。
一、实验原理
为了验证X和Y两个蛋白是否有相互作用，原核表达GST-X和His-Y蛋白，以GST-X蛋白作为诱饵进行pull down实验，所得产物采用His抗体做western-blot检测。根据GST-X的检测结果，判断pull down实验是否成功；根据His-Y的检测结果，判断X和Y蛋白是否存在相互作用。
二、实验材料
2.1 主要仪器
仪器名称 | 品牌 | 货号 |
洁净工作台 | AIRTECH | - |
高速冷冻离心机 | Thermo | - |
脱色摇床 | 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 | - |
蛋白电泳仪 | Bio-Rad | - |
转移电泳槽 | Bio-Rad | - |
混匀仪 | qilinbeier | - |
电子天平 | 常熟市双杰测试仪器厂 | - |
超低温冷冻储存箱 | 中科美菱 | - |
超声波细胞粉碎机 | 宁波新芝生物科技股份有限公司 | - |
磁力搅拌器 | 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 | - |
2.2 主要试剂
耗材名称 | 品牌 | 货号 |
GST树脂 | GE | 17075601 |
GST抗体 | TRANS | HT601 |
His抗体 | 全式金 | HT501 |
TBST | 辉骏生物 | FP1815 |
还原型谷胱甘肽 | Sigma | G4251-5g |
细菌裂解缓冲液 | 辉骏生物 | FP1817 |
电泳缓冲液 | 辉骏生物 | W1802 |
转膜缓冲液 | 辉骏生物 | W1803 |
脱脂奶粉 | Sangon Biotech | A500023-0100 |
BSA | Sangon Biotech | A600669-0250 |
HRP标记山羊抗小鼠IgG | 康为世纪 | CW0102 |
NC膜 | Millipore | - |
胶片 | Fujifilm | - |
三、实验步骤
3.1 融合蛋白的原核表达
（1） 将质粒和GST空载体质粒转化到Rosetta2（DE3）Plyss大肠杆菌菌株中，涂板（已加对应质粒抗性），倒置培养；
（2） 挑单菌落于4mL LB（已加对应质粒抗性），37℃，220rpm，培养过夜；
（3） 将菌液按1:100比例接入30mL LB培养基（已加对应质粒抗性）中，220rmp，37℃培养2-3个小时至菌液OD600值为0.6左右；
（4） 加IPTG诱导，0.1mM IPTG ，16℃培养24h；
（5） 收菌，离心，弃上清。
3.2 Pull down
（1） 取融合表达的GST质粒及GST空载菌，加入PBS溶液，涡旋震荡混匀，4℃ 4000rpm 离心5min，去掉上清，再漂洗两次；向管中加入PBS（已加蛋白酶抑制剂），吹打混匀，放冰上，25%功率超声，每轮超声时间2s，超声间隔2s，超声总时间3min；
（2） 4℃ 12000rpm 离心15min，上清转移到新的EP管中，即提取好的蛋白，从每管中取50ul作为input；
（3） 取适量GST树脂，加入1mL PBS，放混匀仪上室温漂洗2min，500g 4℃离心5min，去掉液体，漂洗两次后，分别加入上清蛋白，放入4℃混匀仪上，孵育2h；
（4） 4℃ 500g 离心5min，去掉上清，向树脂中加入1mL PBS，放混匀仪上，室温漂洗5min， 4 ℃ 500g 离心5min，去掉上清，漂洗两次后，向树脂中加入His蛋白，放4℃ 混匀仪上，孵育过夜；
（5） 第二天，4℃离心3min，5000g，弃上清；将树脂用细菌裂解缓冲液洗3次，4℃离心3min，500g，弃上清；
（6） GST树脂用新鲜配置的PBS+20mM还原性谷胱甘肽洗脱10min (pH 7.4)，4℃离心5min,13000g，将上清吸到一新的1.5mL Ep管中于-80℃保存，即为pull down 产物；
（7） 取pull down产物加入Loading Buffer 95℃ 5min，做Western-blot检测。
3.3 Western blot检测
（1） 按照下表配制好胶
浓度 | 4%浓缩胶（2块胶） | 10%分离胶（2块胶） |
ddH2O mL | 3.04 | 4.05 |
30%acry/bis mL | 0.65 | 3.33 |
Tris-HCl pH8.8 mL | -- | 2.5 |
Tris-HCl pH6.8 mL | 2.5 | -- |
10% SDS μL | 50 | 100 |
20% AP μL | 25 | 50 |
TEMD μL | 5 | 5 |
总体积 mL | 5 | 10 |
（2） 将准备好样品上样，恒流，16mA/胶，直至溴酚蓝跑至胶底部，完成电泳。蛋白互作机制，、苦于实验反复无结果、条带背景杂乱、无直接互作证据，欢迎咨询普拉特泽生物！专业技术团队一对一优化实验方案，高效产出可发文章的高质量实验数据！
