【实操干货】蛋白原核表达完整Protocol，新手也能零失败上手！

为帮助科研工作者、实验人员高效完成蛋白原核表达实验，规避常见坑点，我们整理了一份标准化、可直接套用的完整Protocol，从载体构建到蛋白纯化，每一步都标注关键细节，搭配专属注意事项，新手也能轻松实现高表达、高纯度蛋白制备！

二、蛋白原核表达完整操作Protocol（6步搞定，全程标准化）

Step 1：重组载体转化至宿主菌（核心第一步，确保转化成功）

1. 取BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上解冻（，避免反复冻融）；
2. 加入含目标基因的重组表达载体（质粒浓度≥50ng/μL），轻轻吹打混匀，冰浴30min；
3. 42℃恒温水浴热激90s，迅速转移至冰上冰浴2min（热激时间精准把控，避免影响转化效率）；
4. 加入900μL无抗生素LB培养基，37℃、200rpm恒温摇床培养1h（复苏宿主菌，使载体表达抗性基因）；
5. 取100μL复苏菌液，均匀涂布于含对应抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱倒置培养12-16h，获得单菌落。

Step 2：种子液培养（扩大培养，为大量表达做准备）

1. 用无菌接种环挑取单个阳性单菌落，接种至5mL含对应抗生素的LB液体培养基中；
2. 37℃、220rpm恒温摇床培养8-12h，至菌液OD₆₀₀值达到0.6-0.8（菌液呈浅浑浊状，处于对数生长期，活力最佳）；
3. 种子液培养完成后，4℃、5000rpm离心5min，弃上清，用少量LB培养基重悬菌沉淀，备用（可短期4℃保存，不超过24h）。

Step 3：蛋白诱导表达（核心步骤，把控表达条件）

1. 按1:100的比例，将种子液接种至100mL（小规模）或1L（大规模）含对应抗生素的TB培养基中；
2. 37℃、220rpm恒温摇床培养，至菌液OD₆₀₀值达到0.6-1.0（对数生长期中期，此时诱导表达效率最高）；
3. 加入IPTG储备液，调节终浓度至0.1-1mM（根据目标蛋白特性调整，常规0.5mM，避免浓度过高导致包涵体产生）；
4. 调整培养条件：37℃诱导4-6h（短期诱导，适合可溶性蛋白），或16-25℃诱导12-20h（低温诱导，减少包涵体，提升可溶性）；
5. 诱导结束后，4℃、8000rpm离心10min，收集菌沉淀，弃上清（菌沉淀可-80℃冻存，后续可随时进行蛋白提取）。

Step 4：菌体破碎与蛋白提取（释放目标蛋白，避免蛋白降解）

1. 将菌沉淀置于冰上解冻，按1:10的比例加入预冷的裂解缓冲液（如1g菌沉淀加10mL裂解液），轻轻吹打混匀，冰浴30min；
2. 采用超声波细胞破碎仪破碎菌体：功率200-300W，超声3s、间隔5s，全程冰浴，破碎时间10-15min（直至菌液由浑浊变澄清，无明显沉淀）；
3. 4℃、12000rpm离心20min，收集上清液（含可溶性目标蛋白），弃沉淀（含包涵体及细胞碎片）；
4. 若目标蛋白以包涵体形式存在，需对沉淀进行复性处理（后续补充复性步骤），若为可溶性蛋白，直接进行下一步纯化。

Step 5：蛋白纯化（获得高纯度目标蛋白，适配后续实验）

1. 将Ni-NTA亲和层析介质装入层析柱，用5倍柱体积的PBS缓冲液平衡柱子，流速控制在1-2mL/min；
2. 将提取的蛋白上清液缓慢上样至层析柱，控制流速0.5-1mL/min，确保目标蛋白与Ni-NTA介质充分结合；
3. 用5-10倍柱体积的洗涤缓冲液（PBS+20mM咪唑）洗涤柱子，去除杂蛋白（咪唑浓度可梯度升高，提升杂蛋白去除效果）；
4. 用3-5倍柱体积的洗脱缓冲液（PBS+250mM咪唑）洗脱目标蛋白，收集洗脱液（每1mL收集1管，后续检测蛋白纯度）；
5. 将收集的洗脱液用透析袋透析（或超滤离心），去除咪唑，更换为PBS缓冲液，获得高纯度目标蛋白。

Step 6：蛋白鉴定与保存（确保蛋白活性，便于长期使用）

1. 蛋白纯度鉴定：采用SDS-PAGE电泳检测，考马斯亮蓝染色后，若仅出现目标蛋白对应的条带，说明纯度达标（纯度≥90%可用于后续实验）；
2. 蛋白浓度测定：采用BCA法或 Bradford法，测定蛋白浓度，调节至合适浓度（常规1-10mg/mL）；
3. 蛋白保存：加入50%甘油，分装至EP管中，-80℃长期保存（避免反复冻融，可分装为小份，每次使用取1份）；短期使用可4℃保存，不超过72h。