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【国自然研究热点文献】之外泌体（二）

2023-03-21

来源/作者：普拉特泽-生物医学整体课题外包平台

                                                       
                                                    Hi，各位亲爱滴小伙伴们，本次我们将继续更新外泌体相关的文献。



    本次分享的文献题目是：Exosome-depleted MiR-148a-3p derived from Hepatic Stellate Cells Promotes Tumor Progression via ITGA5/PI3K/Akt Axis in Hepatocellular Carcinoma，影响因子10.75分，发表在International journal of biological sciences杂志上，发表时间为2022年5月。
让我们一起来解析作者的实验结果吧~






一、与肝癌细胞共培养的肝星状细胞（HSCs）的miRNA表达谱




 



为了研究HSC与肿瘤细胞在微环境中的相互作用，作者将人HSC细胞株LX-2分别与三种肝癌细胞株PLC/PRF/5（PLC）、SMMC-7721（7721）和 HCCLM3（LM3）共培养两周（图1A）。利用miRNA阵列分析鉴定共培养LX-2细胞的表达谱。从阵列中存在的2549个miRNAs探针中发现，在PLC, 7721或LM3 LX-2共培养的细胞中分别检测到51、34或61个异常miRNAs（图1B-D）。其中有28个miRNAs是3种共培养细胞中都表达异常的（图1E）。进一步KEGG富集分析发现miR-148a-3p显著参与癌症相关通路（图1F）。根据以上结果，miR-148a-3p被用于后续实验的研究。



 


二、miR-148a-3p在HSCs和原发性肝癌相关成纤维细胞中低表达以及HSC中过表达miR-148a-3p抑制共培养的HCC细胞体外和体内增殖



 



LX-2细胞分别与PLC、7721或LM3共培养，然后检测共培养LX-2细胞中miR-148a-3p的表达。结果显示，与对照组相比，共培养的LX-2细胞中miR-148a-3p的表达均显著降低（图2A）。作者还收集了HCC肿瘤组织，通过磁珠分选出CAFs，检测miR-148a-3p的表达情况。通过对CAFs的形态学观察并结合WB和IHC检测，鉴定CAFs。作者在检测到的17个成对组织样本中，与正常成纤维细胞比较，CAFs中的miR-148a的表达水平均显著下调（图2B）。
为了进一步探讨LX-2中miR-148a-3p对共培养的HCC细胞生物学功能的影响，作者过表达了LX-2细胞中的miR-148a-3p（补充图），过表达miR-148a-3p的LX-2细胞与HCC细胞共培养。结果显示，与过表达miR-148a-3p的LX-2细胞共培养，HCC细胞的细胞活力显著受到抑制（图2C）。另外，LM3和LX-2 OE-miR-148a 或control （LX-2 NC）通过皮下注射入Balb/c无胸腺雄性小鼠中，研究HSCs对HCC的体内作用。4周后，结果显示，注射LX-2 OE-miR-148a相比于对照组，肿瘤组织更小（图2D）。



    


三、miR-148a-3p过表达 HSCs来源的外泌体在体外和体内可抑制肝癌的致瘤功能



 



那么HSCs是如何影响HCC生物学功能的呢？大量的研究提示可能跟外泌体分泌有关。通过一系列实验分离得到HSCs来源的外泌体，随后与HCC细胞孵育，并评估其增殖和侵袭能力。图2E和2F结果显示，miR-148a-3p在与共培养的LX-2细胞的外泌体中低表达，同时HCC患者来源的原发性CAFs分泌的外泌体中的表达也呈低水平状态。利用共聚焦显微镜观察发现，过表达miR-148a-3pLX-2细胞的外泌体可被HCC细胞顺利摄取（图3A）。与对照组相比，在miR-148a-3p过表达的外泌体共培养的HCC细胞表现出更高的miR-148a-3p水平（图3B）。为研究外泌体miR-148a-3p被HCC细胞摄取后是否具有抑癌作用，作者通过测定其增殖和侵袭能力进行评估。结果显示，miR-148a-3p 过表达的外泌体显著抑制肿瘤细胞的增殖能力、细胞活力和侵袭能力（图3C-E）。此外，从转染Cy5标记的hsa-miR-148a-3p agomir或agomir NC 的LX-2细胞培养基中分离得到外泌体，随后，外泌体通过尾静脉注入原位肝肿瘤BALB/c小鼠中，连续注射4周，每周3次。通过扫描激光共聚焦显微镜对肿瘤冷冻切片进行评估，检测到agomir的Cy5信号，表明肿瘤细胞摄取了外泌体（图3F）。而且，过表达miR-148a-3p外泌体可显著抑制肝癌细胞增殖（图3G）。







四、miR-148a-3p作为肿瘤抑制因子，通过靶向ITGA5影响PI3K/Akt信号通路，抑制肝癌细胞的恶性特征



 



为了评估miR-148a-3p在HCC细胞中的功能，作者将过表达的miR-148a慢病毒或对照分别转染到PLC、7721和LM3中。通过实验发现，过表达miR-148a可显著抑制HCC细胞增殖、侵袭和迁移（图4A-C）。为了进一步寻找miR-148a-3p抑制HCC进展的潜在机制，作者在5个miRNA靶基因预测数据库中（miRDB, miRTargetBase, miRanda, TargetScan, picTar）寻找miR-148a-3p的候选靶基因（图4D）。在列出的23个预测靶基因中，基于TCGA-LIHC数据集，选择ITGA5和DNMT1进行进一步研究(图S3)。接下来，作者通过qRT-PCR分析验证靶基因的表达，发现ITGA5与miR-148a-3p的表达变化相反（图4E）。此外，在293T细胞中进行双荧光素酶报告基因检测，结果表明，与ITGA5-3'UTR-WT相比，miR-148a-3p的过表达显著降低了ITGA5-3'UTR-WT的萤火虫荧光素酶活性（图4F和图S4）。另外，目前的实验结果表明PI3K/Akt信号在miR-148a-3p/ITGA5轴诱导的HCC细胞成瘤过程中是必需的。因此，作者评估HCC细胞中过表达miR-148a-3p后PI3K和Akt的水平及其磷酸化状态，结果显示ITGA5、磷酸化PI3K (P-PI3K)和磷酸化Akt (P-Akt)表达显著降低，而E-cad水平水平显著增高（图4G）。这些结果表明，miR-148a-3p/ITGA5轴通过EMT调控PI3K/Akt信号的活性，介导HCC细胞的恶性特征。         m  




五、miR-148a-3p和ITGA5与HCC患者预后相关


 


为了探讨miR-148a-3p在HCC患者中表达的临床意义，作者通过TCGA-LIHC数据集发现，与正常组织相比，miR-148a-3p在肝癌组织中表达下调，而且GSE 36915数据集验证了这一结果（图5A-5B）。根据miR-148a-3p在肿瘤组织中的中位表达量将患者分为高表达亚组和低表达亚组。结果表明，miR-148a-3p低表达患者的OS时间明显短于高表达组（图5C）。随后对中山医院146例HCC患者血浆样本进行生存分析。结合TCGA数据，血浆中miR-148a-3p低表达患者的OS时间明显较短（图5D）。利用TCGA数据库检测HCC患者的ITGA5，发现ITGA5在肿瘤组织中明显上调，这与HCC患者的OS较差有关（图5E-F）。



所有的实验结果就都解读完了。



                                                                       此篇文献分享到这就结束了哦！


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