酵母双杂交实验

      蛋白互作是机体各项生命活动的基础，酵母双杂交是体内筛选、验证蛋白互作的经典技术。依托酵母活细胞体系，支持点对点验证和文库大规模筛选，帮助科研人员挖掘新的互作蛋白，构建蛋白调控网络。今天普拉特泽生物整理酵母双杂交全流程要点 + 实验结果解读干货，帮大家避开实验坑，高效分析蛋白互作数据。

二、酵母双杂交(Y2H)

双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）是一种广泛使用的分子生物学技术，用于研究蛋白质间的相互作用。以下是双杂交实验的详细介绍，包括实验流程和结果解析。

实验流程

1. 构建表达载体：

• 选择目标蛋白
  ：选择要研究的两个蛋白质，通常称为“诱饵”（bait）和“猎物”（prey）。
• 构建诱饵载体
  ：将诱饵蛋白的编码基因克隆到一个表达载体中，该载体通常包含转录因子DNA结合域（BD）。
• 构建猎物载体
  ：将猎物蛋白的编码基因克隆到另一个表达载体中，该载体通常包含转录因子激活域（AD）。

2. 转化酵母细胞：

• 将含有诱饵载体和猎物载体的质粒转化到酵母细胞中。通常使用的酵母菌株是Saccharomyces cerevisiae。

3. 筛选转化菌株：

• 在缺乏选择性培养基（如缺乏某些氨基酸或抗生素）的条件下培养转化后的酵母细胞。只有成功转化了诱饵和猎物载体的细胞才能存活。

4. 诱导表达：

• 在适当的培养基中诱导诱饵和猎物蛋白的表达。通常会使用含有特定糖类（如葡萄糖或乳糖）的培养基。

5. 检测相互作用：

• 通过添加选择性培养基（通常缺乏某些营养物质）来检测酵母细胞的生长情况。如果诱饵和猎物之间发生相互作用，转录因子将被激活，启动下游报告基因（如酵母的β-半乳糖苷酶或荧光蛋白）的表达。

结果解析

1. 生长检测：

• 通过观察在选择性培养基上的生长情况来判断蛋白质之间的相互作用。如果酵母细胞在选择性培养基上能够生长，说明诱饵和猎物之间存在相互作用。

2. 报告基因活性检测：

• 通过测定报告基因的活性（如β-半乳糖苷酶或荧光信号）来定量分析相互作用的强度。可以使用酶活性测定或荧光成像等方法。

3. 特异性验证：

• 为了确认相互作用的特异性，可以进行对照实验，例如使用不相关的蛋白质作为诱饵或猎物，或者进行突变分析。

1. 相互作用的强度

• 在二缺板上，某些蛋白质之间的相互作用可能足够强，能够启动报告基因的表达，支持细胞在该条件下生长。
• 然而，在四缺板上，可能需要更强的相互作用才能满足所有四种营养物质的需求。如果相互作用较弱，可能无法激活足够的报告基因表达，从而导致在四缺板上无法生长。

2. 抗性基因的表达

• 在双杂交实验中，诱饵和猎物的相互作用通常激活某些抗性基因（如转录因子）。在二缺板上，可能只需要激活一部分抗性基因即可满足生长需求。
• 在四缺板上，可能需要更全面的转录激活，才能满足对所有缺失营养物质的需求，这对于相互作用的强度和稳定性提出了更高的要求。

3. 实验设计的考虑

• 在一些实验中，研究人员可能会选择在二缺板上进行初步筛选，以便快速识别潜在的相互作用。然后，进一步在四缺板上进行验证，以确认相互作用的特异性和强度。

这个酵母双杂交载体构建图展示了一个特定的载体（pGADT7-VvbHLH036）及其组成部分。以下是对图中各个元素的解释：

1. pGADT7-VvbHLH036

• pGADT7
  这是载体的名称，表示它是一个用于酵母双杂交实验的质粒载体。GAD代表“Gal4 Activation Domain”，用于转录激活。
• VvbHLH036
  这是目标基因的名称，是一个特定的转录因子，带有HLH（Helix-Loop-Helix）结构域。

2. P_ADH1

• 这是一个启动子，来源于酵母的ADH1基因（醇脱氢酶基因）。它通常用于驱动下游基因的表达，确保VvbHLH036的表达。

3. GAL4AD

• 这是Gal4转录因子的激活域，负责与诱饵蛋白相互作用，激活下游基因的转录。

4. LEU2

• 这是一个选择标记基因，编码亮氨酸的合成途径。只有在有LEU2表达的情况下，缺乏亮氨酸的酵母细胞才能生长，作为选择性标记。

5. P_Thr-phis2 和 P_mThr-phis2

• 这两个部分代表不同的启动子（P_Thr-phis2和P_mThr-phis2），它们可能用于驱动下游基因（如HIS3和TRP1）的表达。具体来说：
• P_Thr-phis2
  可能是一个与丝氨酸合成相关的启动子，后面跟着一个特定的序列（如“CACGTG”），这可能是某种调控元件。
• P_mThr-phis2
  类似于上面的启动子，但可能有不同的调控序列（如“CAAAAG”）。

6. HIS3 和 TRP1

• HIS3
  这是另一个选择标记基因，负责组氨酸的合成。缺乏组氨酸的酵母细胞只有在成功表达HIS3的情况下才能生长。
• TRP1

  这是一个编码色氨酸合成的基因，类似于HIS3，也是一个选择标记基因。

• 规范的前期质控和多组对照设计，是降低酵母双杂交假阳性的核心。如果诱饵载体难构建、文库筛选周期长，可交由专业团队完成。

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