慢病毒是一种逆转录病毒，它可以将遗传信息整合到宿主细胞的基因组当中，从而实现基因的稳定长期表达，我们所说的稳转一般指的就是慢病毒感染。也就是将质粒先包装为慢病毒，再用慢病毒去感染宿主细胞，将遗传信息整合到宿主细胞的基因组当中，从而实现基因的长期稳定表达，基因不会随着细胞的传代而消失。还有一种是瞬转，就是指用质粒直接转染，瞬转进入细胞当中的质粒是不会将遗传信息整合到宿主细胞的基因组当中，因此瞬转转入的基因会随着细胞传代而消失。普拉特泽生物可提供载体构建、慢病毒包装浓缩、滴度检测、稳转株构建一站式科研外包服务。
一、材料准备
1. 三质粒系统（10 cm 皿配比）
表格
| 质粒 | 用量 | 功能 |
|---|---|---|
| 转移质粒 | 10 μg | 携带目的基因及抗性标记 |
| psPAX2 | 7.5 μg | 表达 Gag/Pol 包装蛋白 |
| pMD2.G | 2.5 μg | 表达 VSV-G 包膜蛋白 |
质粒要求：去内毒素，A260/A280=1.8–2.0
2. 细胞与试剂
293T 低代次对数期细胞；PEI/Lipo3000 转染试剂；无抗生素 DMEM+10% FBS；0.45 μm PES 滤器、无菌离心管。
二、实验流程
- Day0 铺板：5–6×10⁶ 个 293T 接种 10 cm 皿，转染汇合度 70–80%
- Day1 转染（PEI 法） ① 总质粒 20 μg、PEI 按质量比 DNA:PEI=1:3，分别用无血清 DMEM 稀释 ② PEI 滴入质粒，室温静置 15–20 min ③ 加入细胞，6–8 h 后换完全培养基
- Day2（可选）：更换新鲜培养基；细胞轻微脱落属于正常现象
- Day3 & Day4 收毒（48 h、72 h 两次收集） ① 收集上清，4℃，500×g 离心 5 min 去除碎片 ② 0.45 μm 滤器过滤 ③ 分装，-80℃保存，避免反复冻融
三、病毒浓缩（可选，高滴度需求）
- PEG 沉淀法（简易）：上清调配至 8.5% PEG8000、0.3 M NaCl，4℃过夜；7000×g 离心 30 min，沉淀用 PBS 重悬，浓缩 100–500 倍
- 超速离心法（高纯度）：4℃，50000×g 离心 2 h，少量 PBS 重悬沉淀
四、滴度检测（qPCR 法）
病毒感染 293T 细胞（添加 8 μg/mL Polybrene），72 h 后提取基因组 DNA，针对 WPRE / 抗性基因 qPCR 定量。 参考滴度：未浓缩 10⁶–10⁷ IU/mL；浓缩后 10⁸–10⁹ IU/mL。
五、关键注意事项
- 慢病毒为 BSL-2 材料，操作需在二级生物安全柜内完成
- 293T 控制低代次＜P20，保证细胞活性
- 全程收毒、过滤尽量 4℃操作，减少病毒失活
- 病毒小体积分装，反复冻融滴度下降 20–50%
- 细胞感染可添加 4–8 μg/mL Polybrene 提升感染效率
六、普拉特泽生物服务
可承接载体构建、慢病毒包装浓缩、滴度检测、稳转细胞株构建全流程外包，标准化操作，定期反馈进度，交付病毒成品 + 完整实验报告。
