Western Blot（WB）完整实验操作方法

一、蛋白提取（前置准备）

1. 快、准、冷原则：全程冰上操作。细胞蛋白提取使用 4℃预冷 PBS；组织蛋白提取时研磨珠、研磨仪、EP 管均提前 4℃预冷，保证样品新鲜，操作迅速。
2. 裂解液配制：RIPA 裂解液按照 PMSF:RIPA=1:100 加入蛋白酶抑制剂，裂解液现用现配。
3. 样本保存：蛋白样品分装，‑80℃保存，严禁反复冻融，防止蛋白结构被破坏。提取完成后测定蛋白浓度，蛋白样品煮沸变性备用。

二、制胶

1. 玻璃板洗净烘干，组装后验漏；枪头置于两板胶室，沿玻璃板壁缓慢注入分离胶，加至玻璃板 2/3 高度，注入完成后用无水乙醇或者纯水封胶。
2. 待分离胶充分凝固，倒掉上层封胶液体，用滤纸吸干残留液体。
3. 配制 5% 浓缩胶并混匀，灌满玻璃板剩余空间；梳子水平垂直插入浓缩胶，规避气泡产生，等待胶体凝固。

三、电泳

1. 缓慢均匀拔出梳子，防止上样孔变形；电泳液现配现用，加到电泳槽 Blotting 刻度线附近。
2. 上样：Marker 上样 4 μL，变性蛋白样本按照定量结果上样；移液枪吸‑打二三次混匀样品，匀速缓慢上样，保证各孔上样量一致。
3. 盖紧电泳槽，保证槽体边缘密闭不漏液；漏液会造成电压不稳，引发条带变形、偏移、模糊。
4. 电泳条件：上层浓缩胶80 V，待蛋白 Marker 分离进入分离胶后切换电压，下层分离胶120 V，电泳至合适位置即可停止。

四、转膜

1. 裁剪适配大小 PVDF 膜，无水甲醇浸泡 15 s 完成膜的激活。
2. 托盘加入预冷转膜液，充分浸润转膜三明治夹；按照黑胶白膜顺序摆放：海绵‑滤纸‑凝胶‑PVDF 膜‑滤纸‑海绵，胶与膜之间不能存留气泡，闭合三明治夹。

要点：凝胶对应黑色面，PVDF 膜对应白色面。

3. 三明治夹放入转印槽，电极遵循黑对黑、红对红；倒入 4℃预冷转膜液。
4. 转印槽空隙放置冰袋，整套装置置于碎冰环境进行转膜，低温避免蛋白降解、条带高温变形。

五、封闭

六、一抗孵育

GPX4 抗体（Abmart，货号 T56959）

1. 回收封闭液，TBST 简单润洗膜；配制抗体工作液，可使用抗体稀释液或者封闭液稀释。
   • GPX4 目的蛋白：抗体：抗体稀释液 = 1:1000（可在 1:1000‑1:20000 区间优化）
   • 内参（如 GAPDH）：抗体：抗体稀释液 = 1:2000
2. 将 PVDF 膜完全浸没于一抗工作液，放入抗体孵育盒，4℃摇床过夜孵育，不要孵育过久。

七、二抗孵育

1. 回收一抗，TBST 洗膜，室温摇床洗涤 3 次，每次 5‑10 min。
2. 配制二抗工作液：二抗：抗体稀释液 = 1:5000。
3. PVDF 膜浸泡在二抗溶液，室温摇床孵育约 2 h。

八、显影

1. 回收二抗，TBST 洗膜 3 次，每次 5‑10 min。
2. 显影液 A 液、B 液按照 1:1 避光混匀。
3. 将显影液均匀覆盖 PVDF 膜，使用化学发光成像系统采集图像，获得蛋白条带结果。

关键注意要点总结

1. 小分子蛋白（如 GPX4 17 kDa）优先选择 0.22 μm 孔径 PVDF 膜，高浓度分离胶（12%）；
2. 转膜全程低温，防止小分子蛋白降解；
3. 各步洗膜充分，封闭要到位，减少背景杂斑；
4. 蛋白提取严格冰上操作，裂解液现配现用，蛋白样本杜绝反复冻融。                                                                                                                     WB 实验步骤链条长，制胶、转膜、抗体孵育任一环节都将直接影响最终条带质量，尤其是 GPX4 这类小分子蛋白，参数选择不当极易出现条带弱、漏转、背景高等问题。普拉特泽生物可承接 WB 完整技术服务，从蛋白样本制备、凝胶电泳、转膜孵育到成像分析一站式完成，针对小分子蛋白拥有成熟优化方案，助力科研人员高效获得稳定、可靠的 WB 实验数据。