一、细胞铺板
将细胞接种于 6 孔板，加入完全培养基进行培养，过夜生长至80% 汇合度。
细胞密度是转染效率的关键条件：密度过低细胞状态差、耐受能力弱，容易出现大量死亡；密度过高则细胞增殖停滞，会显著降低质粒摄取效率。
二、脂质体 - DNA 复合物形成
- 分别使用无血清培养基（Opti-MEM）稀释质粒 DNA 与脂质体转染试剂；
- 将两份稀释液体轻柔混匀，室温静置孵育 15~30 min，形成脂质体 - DNA 复合物。 ✅ 核心原理：质粒 DNA 带负电，阳离子脂质体带正电，依靠静电相互作用结合，组装形成 Lipoplex 复合物。
三、细胞转染
将制备好的脂质体 - DNA 复合物缓慢加入孔板，沿十字方向轻轻晃动混匀，放入培养箱孵育 4–6 h。
注意：此阶段体系建议使用无血清培养基，血清成分会干扰脂质体与质粒的结合，降低转染效率。
四、更换完全培养基
孵育 4~6 h 后，弃去转染培养液，更换含有血清的完全培养基继续培养。
目的：降低脂质体长期作用带来的细胞毒性，保障细胞正常存活，持续表达外源基因。细胞继续培养 24–72 h 等待目的基因表达。
五、样本收集与结果检测
培养至合适时间点即可收集细胞开展验证：
- 蛋白水平（WB 免疫印迹）：多数蛋白在转染后 48–72 h 表达量达到峰值，检测目的蛋白表达变化；
- mRNA 水平（RT-PCR/PCR）：验证目的基因转录水平，用于初步判断转染是否成功。
实验要点总结
脂质体瞬时转染成败取决于细胞汇合度、质粒与转染试剂比例、孵育时间、血清控制四大要素。规范操作流程，合理设置阴性对照、空载对照，才能稳定获得可靠的实验数据。
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