一、 实验目的
验证****、****蛋白之间的互作关系。
二、 实验样本
三、 实验结果
3.1 引物信息列表
引物命名 | 引物序列（5’→3’) | 引物来源 |
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3.2 实验参数
(1) 逆转录
(2) RT-qPCR反应体系配置
成分 | 体积 |
2 × PCR MIX | 5 μL |
Primer-F(10 μM) | 0.5 μL |
Primer-R(10 μM) | 0.5 μL |
cDNA | 2 μL |
灭菌蒸馏水 | up to 10 μL |
(3) 扩增程序设置：
For mRNA：
循环数 | Step | 温度 | 时间 | 说明 |
10 | 1 | 94℃ | 5min | 起始模板变性 |
2 | 94℃ | 30 s | 模板变性 | |
3 | 58℃ | 30s | 退火 | |
4 | 72℃ | 20 s | 延伸 | |
25 | 5 | 94℃ | 30s | 模板变性 |
6 | 53℃ | 30s | 退火 | |
7 | 72℃ | 20s | 延伸 | |
1 | 8 | 72℃ | 10min | 充分延伸 |
3.4 PCR检测结果（报告中仅展示最终结果，原始材料见其它提交文件）
图1 RIP实验结果-电泳图
图2 RIP实验-分析数据
图3 扩增曲线+熔解曲线
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关于统计分析说明：（模板文字请勿删除）
① 如样本未设置平行样本，或无独立生物学重复样本，则默认不做统计学分析。
② 如样本设置了3个以上平行样本，则分析时取该样本各平行样本的均值及标准差。
③ 如组内有多个样本，且每个样本设置有3个以上平行样本或3次以上独立生物学重复样本，则分析时取每个样本各平行样本的均值及标准差，或以组内样本间的标准差进行统计。
常用统计学方法：
① 仅有2组间的均值比较：独立样本t检验 (Student’s t test)
② 两个及两个以上样本均数差别的显著性检验：方差分析 (ANOVA)
*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001
请注意：因无法获知样本来源、处理、数量、极值含义等信息，我司提交的统计学分析结果仅供参考。如有需要，请根据您的研究方案移步本文件夹中的Graph Pad文件，获取您本次检测结果的原始数据，进行个性化分析。
四、 结果说明
由项目经理补充。
一、 RIP实验原理
RIP实验研究的是RNA-蛋白之间的相互作用，运用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，通过免疫学方法将RNA-蛋白复合物一起分离出来，通过对目的片段的纯化与检测（结合的RNA序列通过microarCALU-1y（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定），从而分析蛋白质和RNA相互作用的信息。
二、 实验通用仪器及试剂
2.1 主要仪器
仪器名称 | 型号 | 品牌 |
电泳仪 | Tanon | EPS-300 |
PCR仪 | life technologies | proflex |
凝胶成像系统 | Tanon | Tanon 1600 |
水平电泳槽 | Tanon | HE-120 |
洁净工作台 | AIRTECH | 8W-CF2FD |
数显恒温水浴锅 | 上海博讯 | HHS-11-1 |
台式冷冻离心机 | thermo | fresc017 |
2.2 主要试剂
产品名称 | 货号 | 品牌 |
RIP试剂盒 | 伯信 | Bes5101 |
2 × PCR MIX | 天根 | KT211 |
1.5 mL EP管 | 百赛生物 | BS2001015 |
苯酚：氯仿：异戊醇 | 鼎国 | NEP041 |
无水乙醇 |
| 国药集团 |
Ago2抗体 | CST | 2897T |
三、 实验步骤
3.1 细胞裂解
(1) 加入1 mL PBS洗涤细胞，室温100g离心5 min收集细胞弃上清；重复一次。
(2) 细胞沉淀中加入0.9 mL polysome lysis buffer，9 µL Protease inhibitor，4.5 µL RNase inhibitor涡旋混匀，冰上放置 10 min。
3.2 去除 DNA
(1) 细胞裂解液中加4.5 μL DNase salt stock、10 μL DNase (20 U)，37℃温育10 min。
(2) 转移样品到冰浴环境，快速加入4.5 μL 0.5 M EDTA、1.8 μL 0.5 M EGTA、9 μL DTT，混匀。
(3) 4℃，16,000 g 离心10 min转移上清至新的无RNase离心管中。
3.3 平衡 protein A/G
(1) 每组RIP样品准备20 µL protein A/G beads，加入0.5 mL polysome lysis buffer，颠倒混匀，磁力架上去上清； 重复洗一次。
(2) 加入20 µL polysome lysis buffer 恢复初始体积。
3.4 免疫沉淀
(1) 将细胞裂解样品按照0.8 mL（IP）、0.1 mL（Input）分成两份，Input样品-80℃保存备用。
(2) IP 样品加入实验抗体或者IgG（阴性对照），垂直混匀器 4℃孵育16 h（过夜）。
(3) IP 样品加入准备好的20 µL protein A/G beads，垂直混匀器 4℃孵育1h，磁力架收集磁珠并去上清。
(4) IP 样品加入0.5 mL polysome washing buffer 1、 5 µL DTT洗涤三次去上清， 每次4℃孵育5min。
(5) IP 样品中加入94.5 μL polysome washing buffer 1、 0.5 μL DNase salt stock、5 μL DNase (5 U)，37℃温育10 min后去上清。
(6) IP 样品加入0.5 mL polysome washing buffer 2、5 µL DTT洗涤两次去上清，每次4℃孵育5min。
(7) IP样品加入100 µL polysome elution buffer、1 µL DTT及2 µL proteinase K重悬珠子，Input样品加入1 µL DTT及2 µL proteinase K。
(8) 55℃孵育1 h，洗脱RNA，磁力架收集磁珠转移上清至新的无RNA酶离心管中。
3.5 提取 RNA
(1) 上清加入等洗脱体积(100 µL)苯酚-氯仿-异戊醇混合液到IP和Input样品，颠倒混匀15秒。
(2) 13000 g，4℃离心10min，收集上层水相，转移到新无RNA离心管中。
(3) 加入1 µL Glycogen，10 µL sodium acetate及250 µL 100% ethanol充分颠倒混匀。
(4) –20℃静置3 h到过夜沉淀RNA样品。
(5) 4℃，16000 g 离心30min，弃上清。
(6) 加入1 mL预冷的80%乙醇，4℃，16100 g 离心10min，弃上清，室温风干10min。
(7) 加入30 µL RNase-free water溶解RNA，-80℃保存。
3.6 RNA检测
(1)取2 μL RNA样品检测RNA浓度。
3.7 结合RNA效率验证（PCR)
(1)参考逆转录试剂盒说明书逆转录RNA样品。
(2)参考PCR试剂盒配置反应体系进行PCR，取10 µL PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳。
