GST pull-down 是验证蛋白体外直接物理结合的经典“金标准”技术。它利用 GST 标签与固相化谷胱甘肽（GSH）的高特异性亲和结合，将诱饵蛋白固定在树脂上，从而“钓”出与其直接互作的猎物蛋白。以下是标准的实验操作流程及避坑指南。
实验前准备
• 样本准备：实验组需准备含 GST 融合蛋白（诱饵蛋白）的细菌裂解液或纯化蛋白，以及含目标蛋白（猎物蛋白）的细胞裂解液或纯化蛋白；对照组需准备空 GST 标签蛋白。详细实验步骤
• GST 融合蛋白的表达与纯化：将重组质粒转化至 BL21(DE3)感受态细胞，IPTG 诱导表达（建议 16-20℃ 低温诱导以提高可溶性）。超声破碎菌体后离心取上清，加入谷胱甘肽珠子 4℃ 孵育纯化，洗涤后获得结合在珠子上的 GST 融合蛋白。
• 磁珠预处理：取适量谷胱甘肽磁珠或琼脂糖珠，用预冷的结合缓冲液洗涤 3 次，去除保存液及杂质，离心弃上清备用。
• 诱饵蛋白固定：将纯化的 GST 融合蛋白与预处理好的磁珠混合，4℃ 旋转孵育 1-2 小时。孵育后洗涤 3 次，去除未结合的杂蛋白。阴性对照组使用等量的空 GST 蛋白同步操作。
• 互作反应（Pull-down）：向结合有诱饵蛋白的磁珠中加入含猎物蛋白的细胞裂解液或纯化蛋白溶液，用结合缓冲液补足体积。4℃ 旋转孵育 2-4 小时或过夜，使蛋白充分结合。同时预留 5%-10% 的猎物蛋白作为 Input 对照。
• 严格洗涤：4℃ 离心弃上清，加入预冷的洗涤缓冲液重悬磁珠，轻柔洗涤 4-5 次，每次离心彻底弃上清。此步骤旨在去除非特异性吸附的杂蛋白，若背景较脏可适当提高洗涤液中的 NaCl 浓度（如 500 mM）。
• 洗脱与检测：向洗涤后的磁珠中加入 SDS-PAGE 上样缓冲液，95℃ 煮沸 5-10 分钟洗脱蛋白复合物。离心取上清，进行 SDS-PAGE 电泳和 Western Blot 检测。使用抗猎物蛋白抗体检测互作条带，使用抗 GST 抗体验证诱饵蛋白挂珠情况。
• 必须设置阴性对照：实验必须设置 GST 空载体（Empty Vector）对照组，以排除猎物蛋白与 GST 标签或磁珠本身的非特异性结合，这是审稿人判断数据严谨性的核心依据。
• 全程低温与防降解：蛋白提取、孵育及洗涤过程尽量在冰上或 4℃ 进行，并在所有缓冲液中加入足量的蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解导致假阴性。
• 优化洗涤条件：洗涤不充分会导致 WB 背景杂乱、杂带多；洗涤过于严格（如盐浓度过高）则可能破坏弱相互作用。可根据预实验结果调整洗涤缓冲液中的去污剂（如 Triton X-100）和盐浓度。
• 注意假阳性干扰：若研究的蛋白涉及 DNA 结合，两种不互作的蛋白可能会因 DNA 的存在而出现假阳性。建议在裂解液或缓冲液中加入适量核酸酶（如 DNase I 和 RNase A）以消除核酸介导的间接结合。
• 标签折叠影响：GST 标签肽链较长，可能会影响部分目的蛋白的正确折叠。若实验结果为阴性，需考虑诱饵蛋白是否失活，可通过 SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色确认蛋白表达和纯化情况。
