我们都知道Western Blotting，即蛋白质印迹或免疫印迹，是一种基于抗原-抗体特异性结合的生物化学分析技术，利用蛋白质的电泳迁移率差异，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将蛋白质分离，随后将分离的蛋白质转移到固相载体(如PVDF膜或NC膜)上。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blotting实验的整个过程。分别是从蛋白质样品制备、蛋白定量、电泳、转膜、封闭、孵育抗体(也称免疫反应)、化学发光、显影、定影，最后进行数据分析。通过了解了Western Blotting实验流程后，有着比较清晰的轮廓，对于我们后续分析常见且容易忽略的细节有着巨大的帮助。下面我们进行整理分析常见且容易忽略的细节问题吧！
1. 调控胶的凝固时间：
我们经常在在配制SDS-PAGE胶时，很容易犯一个很常见的错误，就是胶的凝固时间无法很好的控制，如夏天和冬天制胶就会出现很明显的凝固时间不同。这是因为夏天温度较高则有利于胶的快速凝固，而冬天温度较低则胶的凝固时间会出现延长。如果需要加快胶的凝固，可以将胶置于37℃恒温箱中或者增加TEMED促凝剂的量也可以加快胶的凝固时间(如：在配制1块10%的胶时，所加入TEMED的体积为2μl，若需要加快凝固，可以增加至4μl甚至8μl，但需谨慎操作。因为TEMED是促凝剂，浓度过高会导致凝固时间缩短。如果操作不当，可能会造成胶液在加入之前已经开始凝固的情况，这将影响实验结果的准确性)。
因此，在Western blot实验中，在不同的环境或天气下，胶的凝固时间也会出现些许变化。所以，调控胶的凝固时间是一个非常关键的因素，可以提高实验效率。
2. 用于免疫印迹的膜及其预处理：
我们知道在转膜时，常用PVDF膜或NC膜。在这里有个细节没注意到也很容易导致Western blot实验失败。
PVDF膜的预处理: 将切好的PVDF膜与滤纸放入甲醇中浸泡10秒(浸泡时间可根据实验条件进行适当调整)，这一步是为了增加PVDF膜的润湿性和亲水性，因为PVDF膜本身是疏水性的。随后将PVDF膜移至电转缓冲液中浸泡至少10分钟(去除甲醇残留)，以确保膜在转膜过程中能保持良好的导电性和吸附性，甲醇浸泡和转膜缓冲液清洗，能够提高膜表面的活性，增强与蛋白质之间的结合，从而确保实验的准确性和成功率。然后在盛有转膜液的容器中(如搪瓷盘)，按照“负极(黑色面)→海绵→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵→正极(红色面)”的顺序组装好转膜三明治结构。注意，每层之间不能有气泡，否则会影响转膜效果(否则容易出现条带空斑，如最上面的那副图一样)。
因此，在Western blot实验中，在不同的环境或天气下，胶的凝固时间也会出现些许变化。所以，调控胶的凝固时间是一个非常关键的因素，可以提高实验效率。
NC膜的预处理: 与PVDF膜类似，NC膜在转膜前也需要进行预处理和组装转膜三明治结构。但需要注意的是，NC膜通常不需要像PVDF膜那样在甲醇中浸泡很长时间，因为其本身具有较好的亲水性。在根据制造商的建议进行NC膜的预处理步骤(使用转膜缓冲液充分润湿膜表面，这有助于提高蛋白质在膜上的吸附效率)，以去除残余物质并增加膜表面的活性。注意，每层之间不能有气泡，否则会影响转膜效果(否则容易出现条带空斑，如最上面的那副图一样)。
根据待转移的蛋白分子的大小，选择合适孔径的PVDF膜或NC膜是至关重要的。通常，大于20KD的蛋白适合使用0.45μm的膜，而小于20KD的蛋白则可以选择0.2μm的膜。若选择不当，比如使用0.45μm的膜转移小分子蛋白，则可能导致转移到膜的反面或穿过膜的情况发生，影响实验结果的准确性。
3. 正负电极的对应
在进行电泳实验时，电极的正确对应非常重要。按照“红对红，黑对黑”的原则，红色电极代表正极，黑色电极代表负极。若电极连接错误，即正负极弄反，会导致样品不会沿着预期方向向下移动进入凝胶中，而是朝着上方移动进入电泳缓冲液中，从而引起实验失败。
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