做稳转细胞株绕不开慢病毒！载体构建、三质粒包装、超速浓缩、细胞侵染、表达验证一整套流程步骤繁琐，新手很容易卡在转染效率低、侵染无荧光、目的蛋白不表达等问题。今天整理了整套标准化流程供大家参考。
模块 1：慢病毒载体构建（目的基因克隆至慢病毒载体）
原料
- 慢病毒表达载体（元件：5’LTR、RRE、cPPT、U6/CMV 启动子、目的基因插入区、3’LTR、Amp⁺抗性）
- 目的基因 PCR 纯化产物
操作步骤
- 双酶切：限制性内切酶，37℃，1～2h，切开载体与目的基因两端
- 连接：T4 DNA 连接酶，16℃过夜 / 室温 1～2h
- 转化筛选：连接产物转入感受态细胞，涂布抗性平板
- 扩增提质粒：挑取阳性单克隆摇菌扩增，提取质粒
- 测序验证：测序序列完全匹配后，质粒留存备用
模块 2：慢病毒包装（经典三质粒系统，HEK293T 细胞包装）
包装三质粒组成
- 转移质粒：携带目的基因的慢病毒载体
- 包装质粒 psPAX2
- 包膜质粒 pMD2.G
参考配比
- 质粒质量比：转移质粒 : psPAX2 : pMD2.G = 4 : 3 : 1（μg）
- 转染试剂 PEI：质粒总质量 : PEI = 1 : 3
操作步骤
- 三种质粒混合 PEI 转染试剂，共转染70%～90% 汇合度的 HEK293T 细胞
- 37℃、5% CO₂培养箱孵育 48～72h
关键提醒：HEK293T 细胞活力直接决定病毒产量，细胞状态差会大幅降低病毒滴度
模块 3：慢病毒收集与浓缩（浓缩步骤可选）
步骤
- 收集上清：分别收取转染后 48h、72h 细胞培养液上清
- 粗除碎片：500 g 离心 5 min，去除细胞沉淀
- 除菌过滤：0.45 μm 滤器过滤上清，去除细胞杂质
- 超速浓缩（可选）：25000 rpm，4℃离心 2 h，弃上清，PBS / 无血清培养基重悬病毒沉淀
- 分装保存：分装冻存，-80℃长期保存，-20℃短期保存
补充说明：不浓缩可直接用上清侵染，但病毒效价偏低；超速离心必须配平转子，防止设备损坏
模块 4：慢病毒侵染靶细胞
步骤
- 提前铺细胞：侵染前 24 h 接种目标细胞，细胞汇合度控制 30%～50%
- 配制侵染体系：培养基 + 病毒（设置梯度 MOI）+ 可选 8 μg/mL Polybrene（提升侵染效率）
- 孵育侵染：37℃、5% CO₂孵育 8～12 h
- 换液培养：弃含病毒培养基，更换新鲜完全培养基，继续培养 48～72 h
关键提醒：不同细胞株最优 MOI、Polybrene 浓度差异极大，必须提前做预实验摸索条件
模块5：目的基因检测的四大检测方法：
| 检测手段 | 检测对象 | 操作简述 | 检测目的 |
|---|---|---|---|
| 荧光显微镜观察 | 荧光报告基因（GFP/mCherry） | 直接镜下观察荧光细胞 | 快速粗略评估细胞侵染阳性率 |
| qPCR 检测 | 目的基因 mRNA 转录水平 | 提取细胞总 RNA，反转录后荧光定量 PCR，读取 Ct 值 | 定量检测目的基因转录表达量 |
| Western Blot（WB） | 目的蛋白翻译水平 | 提取细胞总蛋白，电泳转膜抗体孵育显色 | 定性 / 半定量检测目的蛋白表达 |
| 流式细胞术（可选） | 荧光阳性细胞比例、荧光强度 | 消化细胞制成单细胞悬液上机检测 | 精准定量侵染阳性细胞百分比、表达强度 |
慢病毒实验成败高度依赖细胞状态、质粒纯度与病毒滴度，每一步细节都会影响最终结果。这份流程建议保存随时查阅，避开细胞毒性、零表达、低侵染效率等高频坑。如果需要完整可打印的标准化实验 Protocol，也可以私信18570028002获取完整版文档！
