1. EMSA 凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay）
- 原理：转录因子蛋白与标记的启动子探针结合后，复合物分子量变大，电泳迁移速率慢于游离探针，出现阻滞条带。
- 分组设置：游离探针、蛋白 + 探针、竞争冷探针（过量未标记探针）、突变探针、超迁移（加入 TF 特异性抗体）。
- 优势：直观证明TF 蛋白能直接结合启动子 DNA 片段；可定位结合基序。
- 局限：体外体系，不能反映细胞内真实染色质环境。
2. DNA pull-down（DNA 亲和下拉）
- 原理：生物素标记启动子 DNA 片段固定在磁珠，孵育细胞裂解液 / 纯化 TF 蛋白，洗脱后 WB 检测是否富集 TF。
- 对照：突变结合位点的启动子 DNA、无关序列 DNA。
- 拓展：可联合质谱，筛选未知结合的转录因子。
3. ChIP 染色质免疫共沉淀（最核心体内证据）
- 甲醛交联细胞内蛋白 - DNA 复合物；
- 超声破碎染色质；
- TF 特异性抗体沉淀复合物；
- 解交联纯化 DNA；
- qPCR 检测靶启动子富集量。
- 对照：IgG 阴性对照、无抗体对照、突变细胞株对照。
- 升级：ChIP-seq：全基因组定位 TF 所有结合峰，批量筛选靶基因；
- Re-ChIP（双 ChIP）：验证两个 TF 共同结合同一段启动子。
5. CUT&Tag / CUT&RUN（替代 ChIP，优势明显）
无需甲醛交联、超声破碎，温和酶切切割结合位点附近 DNA，背景更低、起始细胞量更少、信噪比远高于传统 ChIP，现在主流替代方案，可做 qPCR 或高通量测序。
6. 双荧光素酶报告基因 Dual-Luciferase
- 构建质粒：
- 野生型 WT：靶基因启动子序列连接萤火虫荧光素酶；
- 突变型 Mut：把 TF 预测结合基序定点突变；
- 共转染：启动子质粒 + TF 过表达质粒 / 空载体；海肾荧光素酶做内参校正转染效率；
- 测荧光值：对比 WT 与 Mut 组荧光差异。
- 结果判断：WT 组荧光显著升高 / 降低，Mut 组回复至基础水平 → TF 通过该位点调控启动子活性。
