双荧光素酶报告系统是一种在分子生物学领域广泛应用的检测技术，主要用于研究基因的转录调控机制。它以两种不同的荧光素酶—萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）为核心，通过检测荧光信号，对基因的转录活性进行定量分析。具有灵敏度高、检测快速、操作简便等优点，因此成为研究基因与转录因子相互作用、miRNA靶基因验证、启动子活性分析等的常用工具。
一、原理与机制
双荧光素酶报告系统的原理基于荧光素酶催化的化学反应，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶能够分别催化各自的底物—荧光素和腔肠素发生氧化反应，产生荧光信号。
将基因调控元件与萤火虫荧光素酶基因构建在同一个表达载体上，形成报告基因载体。将海肾荧光素酶基因构建在另一个载体上，作为内参载体，或者将两种荧光素在一个载体构建在同一载体上。内参载体的作用是校正细胞转染效率、细胞数量等实验过程中的差异，使实验结果更加准确可靠。当载体转染进入细胞后，如果基因调控元件具有活性，就会启动萤火虫荧光素酶基因的表达。细胞裂解后，加入相应的底物，萤火虫荧光素酶催化底物产生荧光信号，信号强度与基因调控元件的活性呈正相关。而海肾荧光素酶的表达不受实验处理因素的影响，其产生的荧光信号作为内参，用于标准化萤火虫荧光素酶的信号。通过计算萤火虫荧光素酶信号与海肾荧光素酶信号的比值，就可以准确反映基因调控元件的转录活性。
实验流程：
例如：我们通过双荧光素酶报告基因检测系统对启动子活性进行分析。
（1）将靶启动子插入到荧光素酶报告基因的上游，构建报告基因质粒；
（2）为减少细胞数目、活力和转染效率等对实验的影响，将带有海肾荧光素酶基因的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，若此靶启动子有活性，则荧光素酶基因就会表达；
（3）裂解细胞，加入特定的荧光素酶底物，与荧光素酶发生反应产生荧光，通过检测荧光的强度测定荧光素酶的活性；
（4）定量萤火虫荧光强度后，淬灭上述荧光反应，加入海肾荧光素酶底物，再次检测荧光强度；
（5）数据处理：计算萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的荧光比值，即可得到相对荧光素酶活性，从而判断启动子的活性。
