染色质免疫共沉淀（ChIP）是解析蛋白质与 DNA 体内相互作用的核心表观遗传学技术，也是研究基因转录调控、组蛋白修饰、转录因子结合位点的经典金标准。该技术能够真实捕捉活细胞内染色质的天然结合状态，精准富集目标蛋白结合的 DNA 片段，为探索基因表达调控机制、挖掘表观遗传调控靶点提供了关键技术支撑。
一、核心原理
- 原位锁定结合：活细胞中用可逆交联剂把目标蛋白和它结合的 DNA 共价固定，防止裂解后二者解离、重排；
- 染色质碎片化：将庞大染色质剪切成 200–500 bp 小片段，保证抗体可高效抓取；
- 抗体特异性富集：目标蛋白抗体结合抗原，把「蛋白 - DNA 复合物」沉淀下来，非结合 DNA 被洗掉；
- 解交联纯化 DNA：拆开蛋白 - DNA 连接，降解蛋白、提纯富集后的 DNA；
- 核酸检测定量 / 定位：用 qPCR 验证特定位点（ChIP-qPCR）或高通量测序全基因组定位（ChIP-seq）。
- 二、实验步骤：
- 1、交联和收集细胞固定交联:待15 cm平皿的细胞长至70%~80%时，弃去原培养基，加入含有终浓度1%甲醛的20ml基础培养基(20ml培养基中加入540ul37%甲醛，混匀)，室温水平摇床10min以固定细胞。弃去上述固定液，用10ml预冷1XPBS润洗一次。终止交联:弃去PBS，加入10ml甘氨酸终止液(10ml1XPBS中，含终浓度为125mM的甘氨酸)，稍晃匀，室温水平摇床5min。
清洗洗涤:弃甘氨酸终止液，加10ml预冷1XPBS润洗细胞一次。收集细胞:加入5ml预冷1XPBS(含终浓度0.5mM PMSF.用前添加)，刮下细胞，收集至15ml圆锥底离心管中，4°C，2500rpm(约720g)离心10min，移弃上清。
暂停点1:此时细胞可冻存-80°C备用，或直接进行后续试验。
如何正确固定实验样本?
1.交联中甲醛浓度一般选用1%的甲醛浓度，室温固定10-15min，时间太短，蛋白和DNA结合不牢固，太长易造成超声困难，破坏蛋白结构。
对于组织一般建议切成1-3mm3大小，交联时间延长至152.min。 - 2.断裂染色质:超声法或者酶消化法
A.超声法
裂解:加入1ml 预冷的细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)重悬细胞，冰上静置30min。
提核:转移至预冷的杜恩斯匀浆器，研磨10下，以释放细胞核。(可取10ul 镜检，如未释放充分，可继续研磨)转移至1.5ml离心管中，4°C、5000rpm(2400g)离心10min收集细胞核。
超声破碎:弃上清，用350ul 剪切液(含蛋白酶抑制剂)重悬细胞核，冰上放置。根据以前优化好的超声实验条件，超声剪切DNA。
收集片段化染色质:超声后，4°C、15000rpm(16000g)离心10min，转移上清至新1.5ml管中，直接进行后续试验，或冻存-80°C备用(暂停点2)。
B.酶消化法
裂解:加入1ml 预冷的细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)重悬细胞，冰上静置30min。
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提核:转移至预冷的杜恩斯匀浆器，研磨10下，以释放细胞核。(可取10ul 镜检，如未释放充分，可继续研磨)转移至1.5ml离心管中，4°C、5000rpm(2400g)离心10min收集细胞核。
酶消化:小心吸弃上清，用350ul 剪切液(含蛋白酶抑制剂)，重悬细胞核，37°C孵育5min。加入一定量(的微球菌核酸酶，37°C20min，中间混匀几次。(酶合适
用量，应预先做梯度摸索。)消化终止:加入7ul0.5MEDTA，终止酶消化。收集片段化染色质:4°C、15000 rpm(16000 g)离心10min，转移上清至新1.5ml管中，直接进行后续试验，或冻存-80°C备用(暂停点2) - 3.检测染色质断裂效果(200-1500bp较合适)
1取50ul染色质上清，加入150ulddH20，10 ul5MNaCI，65°C 4h或过夜，解交联。加入1 ul RNaseA, 37°C,15 min。每管中加入10 ul Proteinase K, 42°C,1.5 h。苯酚/氯仿抽提法纯化或试剂盒纯化DNA片段。取10ul，1%琼脂糖胶电泳检测，观察大小分布;紫外分光光度仪测量浓度。 - 4.免疫沉淀
Input:先取10 ul染色质作为Input对照，冻存留待后续纯化DNA。ChIP反应(设计好对照，对照真的非常非常重要!!!)
反应管:25 ul protein G磁珠，加入10 ul ChIPbuffer 1，7~25 ug 染色质(一般不超过60 ul)，1~3 ug抗体，1 ul 100X PIC，补水100 ul总体积。4°C旋转孵育4h(有时过夜孵育，可能提高灵敏度)。(此处具体参考ChIP试剂盒说明书)阴性对照:用实验抗体同型的IgG作为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段.阳性对照:一般用RNA Polymerase II或者HistoneH3(组蛋白)抗体，理论上ChIP后PCR都会有条带。
沉淀:瞬时离心后，磁性分离，弃上清。
洗涤:依次用800 ul ChIP buffer 1洗涤1次、800 ulChIPbuffer 2洗涤2次。磁性分离弃上清。洗脱:加入50ul ChIP洗脱液，室温混合15min。 - 5.解交联、回收纯化DNA
加入50ul解交联液，混合后磁性分离，转移上清于新1.5ml管中。
取出前面留存的Input对照，加入88ulChIP buffer2和2ul5 M NaCI，65°C2.5 h。(甲醛能够在有盐离子和去污剂的高温环境下解除交联反应，使得蛋白质和DNA分离。)
加2ulProteinase K，混匀后37°C1h。再加入2u终止液。
试剂盒纯化DNA片段。(暂停点3:DNA回收纯化后，可冻存于-20°C备用。)
6.qPCR或者测序检测
qPCR 计算时利用Input做对照(类似普通qPCR中的内参基因)均一化IP产物(CT)，针对阴性抗体富集产物IgG，同样利用Input均一化产物(ACT)。最后计算IP与IgG均一化之后扩增循环数差异(AACT)，并通过2-AACT计算富集倍数。
相对富集=2-AACt
其中:
ACt=Ct (ChIP样本)- Ct(Input)
AACt=ACt(实验组)-ACt(对照组)
ChIP-seq:对Input、IP进行建库和测序可进行ChIP-seq分析 
- 从原理机制到标准化实验流程，ChIP 技术打通了蛋白 - DNA 互作研究的关键通路。凭借稳定可靠的实验体系，它持续助力各类生命科学基础研究，为解析生命活动机制、探索疾病分子机理提供强大的技术助力。
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