【应用简介】

肝纤维化是多种慢性肝病发展至肝硬化的共同病理学基础，虽然对肝纤维化的研究已从细胞水平进入分子水平，但肝纤维化动物模型的建立，仍是临床研究和实验研究的重点和难点。肝纤维化动物模型的建立，既可以深入全面地研究肝纤维化发病机制，又可以为临床筛选防治肝纤维化药物提供基础研究。

【肝纤维化模型构建】

目前肝纤维化动物模型可分为基因相关模型与非基因模型，前者主要是指工程动物模型，非基因模型主要指在相同或相似的遗传背景下，通过环境因素，药物/毒物或其它因素诱导得到的肝纤维化模型。

肝纤维化常用模型有化学试剂诱导法（四氯化碳诱导，硫代乙酰胺诱导），胆管阻塞法（胆管结扎或寄生虫），乙醇诱导法以及免疫法。

【实验方法】

一、化学试剂诱导法

致病机理：

四氯化碳在肝细胞内经CYP2E1代谢产生的自由基可以损伤细胞膜，从而破坏肝细胞的结构和功能，造成肝细胞坏死。同时，肝脏内的星型细胞会活化，释放Ⅳ型胶原酶，降解ⅳ型胶原，合成分泌ⅰ型胶原，而引起胶原沉积和肝纤维化。

动物准备：

雄性的BALB / c小鼠10周龄（BALB / C比C57敏感，造模成功率更高）或SD大鼠（雄性200克左右）等，橄榄油，四氯化碳，注射器，电子天平。

实验步骤：

1、配制四氯化碳溶液，四氯化碳与橄榄油按照体积比1：4混匀，备用；

2、按小鼠体重0.5μL/ g CCl₄（2.5μL CCl₄橄榄油溶液）腹腔注射，每周2次，持续6周，空白对照组仅注射橄榄油2.5μL/ g；

3、在连续给CCl₄ 2周后，可随机抽取对照组和造模组小鼠各3只，检测ALT，AST，TBL以及切片等是否造模成功；

4、若模型成功，即可进行药物评价，继续处理4周后，即可处死小鼠，检测肝纤维化相关的标记，评价药物效果。

二、胆管结扎致肝纤维化

致病机理：

通过手术结扎胆总管的方法，模拟临床上由于胆汁淤塞引起的肝疾病。

动物准备：

雄性C57，只BALB / c小鼠（10周龄左右）或雄性SD大鼠（200克左右）器械：扩创钩，镊子，尖头剪刀，持针钳，圆针，角针，钝性剪刀，刀柄，创巾，棉签，剃毛刀，酒精棉球，碘伏，注射器，缝合线（3号）。

实验步骤：

1、术前麻醉，固定；

2、术部剃毛，擦碘伏，75％酒精脱碘，铺创巾；

3、沿腹中线剪开皮肤，钝性剪刀分离皮下的脂肪和肌肉；

4、皮肤上开到尖状软骨处，拉牵引线，生理盐水冲洗腹腔，扩创钩使皮肤两侧撑开；

5、棉签沾生理盐水拨开肝脏，肠，胰等脏器，在肝脏底部寻找并暴露出胆管（大鼠没有胆囊，在肝脏和十二指肠中间找，小鼠沿着胆囊和十二指肠找）胆管下可看到门静脉血管，与门静脉血管平行的透明黄色的为胆管；

6、用镊子拨开胆管覆盖及周边的脂肪（一定要剥离干净周边的脂肪，否则容易造成结扎线滑脱），找到后把镊子伸到胆管下方拨开脂肪，丝线穿过镊子，在胆管处打结，可扎2道防止造模不成功，生理盐水冲洗腹腔；

7、将内脏归位，先把腹膜缝在一起，然后再将皮肤缝合；

8、每天碘伏消毒，75％酒精亦可；

9、对照组与结扎组操作一致，仅不扎线。

【案例展示】

【技术总结】

1、滴注博来霉素后短时间内小鼠死亡，原因可能有以下几点：

a、药物浓度偏高；b、滴注体积过大；c、麻醉过量致死；d、气管缝合时有血液渗入导致小鼠死亡。

2、滴注后应将小鼠头部抬起，使药物缓缓渗入气管、支气管；

3、选择合适周龄的小鼠进行试验。

【送检流程】

动物及药物代采购

【交付标准】

1、固定组织、实验报告

2、真实实验结果

3、原始图片

4、实验原始数据

5、剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）