在RACE实验中，提高扩增特异性和效率是实验成功的关键。普拉特泽生物承接RACE实验等相关服务上万例，积累了操作大量经验，为大家详细分享RACE实验提高扩增特异性和效率的新方法，同时为广大科研工作者开展线上的理论培训与线下实操
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在RACE实验中，提高扩增特异性和效率是实验成功的关键。以下是一些新方法，可以帮助你在进行RACE实验时提高扩增的特异性和效率：

一、优化引物设计

‌▲选择合适的引物长度和GC含量‌：

引物长度建议为23~28个核苷酸，GC含量为50%~70%。

较高的GC比例和Tm值（≥65℃，若>70℃使用Touchdown PCR）有助于提高产物的特异性。

‌▲设计多条基因特异性引物（GSP）‌：

针对同一待测转录本可设计多条GSP，以提高扩增成功率。

若扩增效果仍然欠佳，则让NGSP（巢式引物）的5'末端与GSP的3'末端有5~15个核苷酸的重叠，有助于提高二轮巢式扩增时的特异性。

▲避免引物自互补和错配‌：

避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。

如果引物的3'末端有大约10个碱基和某个已知基因100%匹配，应坚决弃之不用，以避免后续的PCR反应中将此基因扩增出来。

二、改进反转录和PCR条件

‌●选择合适的反转录酶‌：

3'端的cDNA可使用MMLV酶，而5'端的cDNA则需要更高要求的SMARTScribe酶。

使用具有模板置换活性的逆转录酶和高保真快速扩增，可提高反转录和PCR的效率。

‌●优化PCR扩增条件‌：

采用热启动PCR和Touchdown PCR技术，可提高PCR反应的特异性。

Touchdown PCR是在最开始的循环中，退火温度高于引物的Tm值，以增加对特异性条带的扩增；随后的退火和延伸的温度降回到引物的Tm值，进行随后的PCR循环。

若扩增目的片段>3kb，72℃延伸时长延长至1min；对于较长（>10kb）或丰度较低的转录本，GSP尽量靠近cDNA末端。

●减少非特异性扩增‌：

使用低浓度的外侧引物，并减少第一轮PCR反应的循环数。

然后取第一轮反应产物的1/10~1/20用于一对内侧引物的巢式PCR，进行35~40个循环。

三、提高RNA质量和完整性

‌▲使用高质量的RNA提取方法‌：

尽量保证RNA的纯度，如使用柱式RNA提取试剂盒。

在反转录前检测RNA的完整度，可通过紫外分光光度原理的方法（如NanoDrop）检查A260/A280值（代表蛋白残留的程度，一般在2.0左右）和A260/A230的值（表示盐离子、酚、醇等的残留程度，一般在2.0~2.2）；
或通过琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性（条带是否清晰，是否有完整的2~3条RNA条带）。

‌▲避免RNA降解和污染‌：

【1】RNA提取物中无目的转录本或者目的转录本表达丰度低时，可以设计已知转录本区域的qPCR或PCR引物进行目的产物检测；检测后发现表达丰度低，可以增加RNA模板投入量。

【2】RNA质量直接影响到反转录的效率和cDNA的质量。如果RNA有降解或者含有DNA或蛋白质污染，可能导致反转录效率降低，或者合成的cDNA质量差，这些都会影响到后续的PCR扩增。

▲其他注意事项

‌【1】RNA质量‌：RNA的质量直接影响到反转录的效率和cDNA的质量。因此，在进行RACE之前，需要使用高质量的RNA提取方法，尽量保证RNA的纯度。同时，操作前必须检测RNA的完整度。

【2】试剂盒选择‌：选择高质量的RACE扩增试剂盒，如全式金推出的TransScript® 5'/3' RACE Kit，该试剂盒包含热稳定性高、合成速度快且具有模板置换活性的逆转录酶和高保真快速扩增，可以提高扩增的特异性和效率。

综上所述，通过优化引物设计、选择合适的反转录酶与PCR条件、应用巢式PCR技术以及注意RNA质量和试剂盒选择等方面的方法，可以提高RACE实验的扩增特异性和效率。

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