今天普拉特泽生物跟大家一起学习的是酵母杂交实验的常见问题—转化篇，酵母杂交技术是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的技术，蛋白质作为生命活动中最终的执行者和体现者，被越来越多的科研人员研究。而普拉特泽生物——分子检测平台也非常重视这一点，为广大科研人员提供酵母单双杂实验外包服务，同时也总结了在酵母杂交实验过程中常遇到的各种问题，分享给大家一起共勉！

  问题一：菌种是否需要两次平板活化？

  答：根据菌种生长的具体情况。初始菌为1个月内活化过的酵母平板菌落，只需要进行一次平板活化；新鲜转化产物用于感受态制备，不需要平板活化，直接小摇即可；-80 ℃保存的菌种，建议经过两次平板活化后，选择生长良好的菌落再进行摇菌。

  问题二：感受态制备是否必须经过先小摇，然后再大摇？

  答：是的。标准流程是先小摇，再大摇，保证对数期的酵母细胞的比例，才能得到理想的转化效率；不经小摇，直接过夜大摇，用Coolaber酵母转化试剂盒检测，也可以得到较高的转化效率。单个质粒转化或者是两个质粒共转，可以直接大摇，但进行文库转化，为了得到更多的转化子，必须先小摇后再大摇。

  问题三：感受态制备过程中，菌的浓度有什么要求？

  答：最适的菌浓度OD值=0.5，最好为自然生长的浓度，不是由高浓度稀释而来的浓度。

  问题四：感受态制备完成可以保存多久？

  答：看细胞的具体情况。Super转化Kit和Super转化Kit plus含有经优化的感受态细胞冻存液，-80 ℃感受态细胞可以保存6-12个月。未加冻存液的感受态细胞室温只能保存6 h。

  问题五：转化产物用无菌水和生理盐水重悬有什么区别？

  答：重悬后直接涂板，生理盐水和无菌水无区别；如果过夜后涂板，用生理盐水重悬，细胞的存活率会更高。

  问题六：转化产物一般重悬体积是多少，涂板量是多少？

  答：单个或者两个质粒转化，建议200 μL重悬，直径9 cm培养皿涂布100 μL；文库转化，建议5-10 mL重悬，直径15 cm培养皿涂布300 μL。

  问题七：转化产物的培养温度，以及培养的时间怎么确定？

  答：28-30 ℃培养48 h会有微小菌落出现，3天后会出现较大的乳白色菌落。如果培养基含有抗生素或细胞表达蛋白对自身有毒性，培养时间需延长，菌落也会偏小一些。

  问题八：如何判断是否转化成功？

  答：平板出现乳白色单菌落，直径可达1 mm以上，判断为转化成功；如果平板出现一层菌落，或者菌落都太小，不能挑取单菌落，判断为转化失败。常见的失败多为筛选平板上没能长出任何菌落。

  问题九：酵母转化质粒加入多少合适？

  答：对于高纯度质粒，单转建议质粒加入量100 ng以上，共转建议质粒加入量每种300 ng以上，文库转化建议文库质粒加入量为5-25 μg。质粒的加入量和转化子的数量呈正相关，为了得到较高的转化效率，对于通过NanoDrop定量的质粒，单转和共转均建议每种质粒加入1 μg以上。如出现转化失败的问题，请优先检测质粒的质量，电泳是最为简单有效的方法。

  问题十：转化失败的原因有哪些？

  答：最常见的转化失败为空板，没有菌落长出来。大概率问题出在质粒上，首先需要对质粒进行电泳检测，电泳结果需为大小正确且明亮的条带；其次核对筛选培养基的选用和配制是否正确；排除上述因素，就需要复查酵母菌的外观气味是否正常，或者进行镜检。

  问题十一：文库转化怎么计算转化效率？

  答：文库转化需要尽可能保证文库的完整性，得到尽可能多的转化子。一般认为在缺陷平板（不含报告基因检测缺陷及抗生素平板）上得到十万个以上转化子为合格。比如10 μL的重悬产物，取1 μL稀释到100 μL涂板后得到10个以上克隆，转化实验即为成功的。

  问题十二：线性化质粒转化失败怎么解决？

  答：由于要重组基因组，需要线性化质粒，但其转化效率远远低于环状质粒，一般每μg质粒只能得到50个以内的转化子。由于酶切体系以及纯化方法的影响，造成质粒回收效率低、质量差，是转化失败的主要因素。建议选用质粒大提试剂盒增加质粒的提取量，扩大酶切体系，改善回收方法来解决。酶切完成后，只取少量电泳检测，对于完全酶切的样品，直接用吸附柱纯化；和酶切产物全部电泳后胶回收相比，质粒的损耗率小一些。

  好啦，那所有的酵母杂交操作时的常见问题我们就讲完啦，如果您还有其他操作时的问题我们会第一时间给到回复，如果您有酵母杂交实验外包的需求欢迎随时联系普拉特泽~